Fluorogen-activating proteins provide tunable labeling densities for tracking FcεRI independent of IgE.
Fluorogen-activating proteins provide tunable labeling densities for tracking FcεRI independent of IgE.
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DOI：
10.1021/cb5005146
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发表时间：
2015-02-20
影响因子：
4
通讯作者：
Lidke, Diane S.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Schwartz, Samantha L.;Yan, Oi;Telmer, Cheryl A.;Lidke, Keith A.;Bruchez, Marcel P.;Lidke, Diane S.
多价抗原使肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的 IgE 结合 FcεRI 交联，导致脱颗粒并释放刺激过敏反应的关键炎症介质。在这里，我们提出并表征了荧光激活蛋白（FAP）用于 FcεRI 单粒子追踪的用途，以研究 IgE 诱导肥大细胞行为变化后受体迁移率如何受到影响。 FAP 是基因编码的标签，可结合荧光染料，结合后其亮度增加高达 20,000 倍。我们证明，通过滴定荧光剂浓度，可以实现从整体到单个颗粒的标记密度，与表达水平无关，并且不需要洗涤步骤或光漂白。与 FAP (FAP-γ) 融合的 FcεRI γ 亚基首次提供了一种不依赖于 IgE 的探针，用于在单分子水平上追踪 FcεRI 的信号亚基。我们表明，FcεRI γ 亚基动力学由 IgE 结合 α 亚基控制，并且细胞因子 IgE、SPE-7 诱导肥大细胞活化，而不改变 FcεRI 流动性或促进内化。我们利用孔雀绿 (MG) 荧光团的远红光发射来跟踪相对于动力蛋白-GFP 的 FcεRI，并发现仅在促进快速内吞作用的条件下，固定化受体很容易与动力蛋白招募的位置相关。这些研究证明了 FAP 系统在单分子研究中的有用性，并为 FcεRI 结构、活性和迁移率之间的关系提供了新的见解。
Crosslinking of IgE bound FcεRI on mast cells and basophils by multivalent antigen leads to degranulation and the release of key inflammatory mediators that stimulate the allergic response. Here, we present and characterize the use of fluorogen-activating proteins (FAPs) for single particle tracking of FcεRI to investigate how receptor mobility is influenced after IgE-induced changes in mast cell behavior. FAPs are genetically encoded tags that bind a fluorogen dye and increase its brightness upon binding up to 20,000-fold. We demonstrate that, by titrating fluorogen concentration, labeling densities from ensemble to single particle can be achieved, independent of expression level and without the need for wash steps or photobleaching. The FcεRI γ-subunit fused to a FAP (FAP-γ) provides, for the first time, an IgE-independent probe for tracking this signaling subunit of FcεRI at the single molecule level. We show that the FcεRI γ-subunit dynamics are controlled by the IgE-binding α-subunit and that the cytokinergic IgE, SPE-7, induces mast cell activation without altering FcεRI mobility or promoting internalization. We take advantage of the far-red emission of the malachite green (MG) fluorogen to track FcεRI relative to dynamin–GFP and find that immobilized receptors readily correlate with locations of dynamin recruitment only under conditions that promote rapid endocytosis. These studies demonstrate the usefulness of the FAP system for single molecule studies and have provided new insights into the relationship among FcεRI structure, activity, and mobility.
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DOI：
10.4168/aair.2012.4.6.332
发表时间：
2012-11
期刊：
Allergy, asthma & immunology research
影响因子：
--
作者：
Kashiwakura J;Okayama Y;Furue M;Kabashima K;Shimada S;Ra C;Siraganian RP;Kawakami Y;Kawakami T
通讯作者：
Kawakami T
DOI：
10.1103/physreve.85.061916
发表时间：
2012-06
期刊：
Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics
影响因子：
--
作者：
Michalet X;Berglund AJ
通讯作者：
Berglund AJ
影响因子：
4.4
作者：
Hsu, C;MacGlashan, D
通讯作者：
MacGlashan, D
影响因子：
32.4
作者：
Boniface, JJ;Rabinowitz, JD;Davis, MM
通讯作者：
Davis, MM
影响因子：
32.4
作者：
Andrews, Nicholas L.;Pfeiffer, Janet R.;Lidke, Diane S.
通讯作者：
Lidke, Diane S.