Precise Editing at DNA Replication Forks Enables Multiplex Genome Engineering in Eukaryotes.
Precise Editing at DNA Replication Forks Enables Multiplex Genome Engineering in Eukaryotes.
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DNA复制叉处的精确编辑可以在真核生物中进行多重基因组工程。
DOI：
10.1016/j.cell.2017.10.034
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发表时间：
2017-11-30
期刊：
影响因子：
64.5
通讯作者：
Isaacs FJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Barbieri EM;Muir P;Akhuetie-Oni BO;Yellman CM;Isaacs FJ
我们描述了一种在酿酒酵母中的多重基因组工程技术，该技术基于DNA复制滞后链上合成的寡核苷酸的退火。该机制独立于RAD51导向的同源重组，避免了双链DNA断裂的产生，使染色体在单碱基对分辨率下能够进行精确的染色体修改，效率为>；40%，而不会在目标遗传位点发生意外的突变。我们观察到在一次转化中同时掺入多达12个寡核苷酸和多达60个靶向突变。一个复杂的寡核苷酸池的迭代转化迅速产生了巨大的组合基因组多样性>；105。这种方法被用来使异源β-胡萝卜素生物合成途径多样化，该途径产生的基因变异在启动子、基因和终止子上具有精确的突变，导致类胡萝卜素水平改变。我们的DNA复制、修复和重组保守过程的工程方法可以自动化，并为真核生物的多重组合基因组工程建立了一般策略。复制叉可以在真核基因组中引入多点突变，而不需要双链断裂。
We describe a multiplex genome engineering technology in Saccharomyces cerevisiae based on annealing of synthetic oligonucleotides at the lagging strand of DNA replication. The mechanism is independent of Rad51-directed homologous recombination and avoids the creation of double-strand DNA breaks, enabling precise chromosome modifications at single base-pair resolution with efficiencies >40% without unintended mutagenic changes at the targeted genetic loci. We observed the simultaneous incorporation of up to 12 oligonucleotides with as many as 60 targeted mutations in one transformation. Iterative transformations of a complex pool of oligonucleotides rapidly produced large combinatorial genomic diversity >105. This method was used to diversify a heterologous β-carotene biosynthetic pathway that produced genetic variants with precise mutations in promoters, genes, and terminators, leading to altered carotenoid levels. Our approach of engineering the conserved processes of DNA replication, repair, and recombination could be automated and establishes a general strategy for multiplex combinatorial genome engineering in eukaryotes. Replication forks can be co-opted to introduce multi-site mutations in eukaryotic genomes without the need for double strand breaks.
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影响因子：
14.9
作者：
Carr PA;Wang HH;Sterling B;Isaacs FJ;Lajoie MJ;Xu G;Church GM;Jacobson JM
通讯作者：
Jacobson JM
影响因子：
64.8
作者：
Komor AC;Kim YB;Packer MS;Zuris JA;Liu DR
通讯作者：
Liu DR
DOI：
10.1007/978-1-4939-1363-3_1
发表时间：
2014-01-01
期刊：
YEAST GENETICS: METHODS AND PROTOCOLS
影响因子：
--
作者：
Gietz, R. Daniel
通讯作者：
Gietz, R. Daniel
影响因子：
56.9
作者：
Jinek, Martin;Chylinski, Krzysztof;Charpentier, Emmanuelle
通讯作者：
Charpentier, Emmanuelle
影响因子：
4.7
作者：
DiCarlo, James E.;Conley, Andrew J.;Penttila, Merja;Jantti, Jussi;Wang, Harris H.;Church, George M.
通讯作者：
Church, George M.