A robust two-dimensional separation for top-down tandem mass spectrometry of the low-mass proteome.
A robust two-dimensional separation for top-down tandem mass spectrometry of the low-mass proteome.
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DOI：
10.1016/j.jasms.2009.08.001
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发表时间：
2009-12
影响因子：
3.2
通讯作者：
Kelleher NL
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lee JE;Kellie JF;Tran JC;Tipton JD;Catherman AD;Thomas HM;Ahlf DR;Durbin KR;Vellaichamy A;Ntai I;Marshall AG;Kelleher NL
为了通过分子量(MW)对完整蛋白质进行分级，提出了一种大幅改进的二维(2D)分离方法，以在复杂混合物的自上而下的质谱学分析之前实现可重复性和健壮的分级。GELFrEE(即凝胶洗脱液体组分捕获电泳法)是通过使用Tris-甘氨酸和Tris-Tricine凝胶系统应用于人HeLa S3细胞的胞浆和细胞核提取物来实现的，以实现蛋白质从5到>的分子量分级；对于低质量蛋白质组(5-25 kDa)的自上而下串联质谱学(MS/MS)，使用12或14.5Tesla傅立叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪的纳米毛细管LC-MS/MS对5-8个凝胶洗脱(GE)组分进行采样。单次注射可提供约40种可检测到的蛋白质，其中约一半产生自动ProSight识别。提出了该系统的重复性指标，并对有丝分裂细胞和异步细胞中的蛋白质靶标进行了比较分析。我们提出了这种基本的2D方法，以促进自上而下的质谱学和各种其他蛋白质分离和/或表征方法的更广泛实施。
For fractionation of intact proteins by molecular weight (MW), a sharply improved two-dimensional (2D) separation is presented to drive reproducible and robust fractionation before top-down mass spectrometry of complex mixtures. The “GELFrEE” (i.e., gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis) approach is implemented by use of Tris-glycine and Tris-tricine gel systems applied to human cytosolic and nuclear extracts from HeLa S3 cells, to achieve a MW-based fractionation of proteins from 5 to >100 kDa in 1 h. For top-down tandem mass spectroscopy (MS/MS) of the low-mass proteome (5–25 kDa), between 5 and 8 gel-elution (GE) fractions are sampled by nanocapillary-LC-MS/MS with 12 or 14.5 tesla Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometers. Single injections give about 40 detectable proteins, about half of which yield automated ProSight identifications. Reproducibility metrics of the system are presented, along with comparative analysis of protein targets in mitotic versus asynchronous cells. We forward this basic 2D approach to facilitate wider implementation of top-down mass spectrometry and a variety of other protein separation and/or characterization approaches.
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