The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.
The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.
复制标题
DOI：
10.1093/nar/gkm1044
复制
发表时间：
2008-01
影响因子：
14.9
通讯作者：
Weinzierl RO
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Nottebaum S;Tan L;Trzaska D;Carney HC;Weinzierl RO
大型蛋白质复合物（如RNA聚合酶（RNAP））的深入结构/功能分析需要一个实验平台，该平台能够在体外条件下以可重现的方式大量组装此类酶的变体。在这里，我们描述了一个精简和集成的协议，用于组装重组古细菌RNAP在高通量96孔格式。该程序的所有方面，包括重新设计的表达质粒的构建、自动化蛋白提取/体外组装方法的开发和活性测定，都特别适合在机器人平台上实施。优化的策略允许在24 h内进行96个重组RNAP（包括野生型和突变型变体）的平行组装和活性测定，而很少或没有人为干预。我们证明了该系统的高通量潜力，通过评估的RNAP桥阻碍使用饱和诱变的一个单一的氨基酸位置的侧链的要求。
The in-depth structure/function analysis of large protein complexes, such as RNA polymerases (RNAPs), requires an experimental platform capable of assembling variants of such enzymes in large numbers in a reproducible manner under defined in vitro conditions. Here we describe a streamlined and integrated protocol for assembling recombinant archaeal RNAPs in a high-throughput 96-well format. All aspects of the procedure including construction of redesigned expression plasmids, development of automated protein extraction/in vitro assembly methods and activity assays were specifically adapted for implementation on robotic platforms. The optimized strategy allows the parallel assembly and activity assay of 96 recombinant RNAPs (including wild-type and mutant variants) with little or no human intervention within 24 h. We demonstrate the high-throughput potential of this system by evaluating the side-chain requirements of a single amino acid position of the RNAP Bridge Helix using saturation mutagenesis.
登录
查看更多内容
影响因子：
16
作者：
Kettenberger, H;Armache, KJ;Cramer, P
通讯作者：
Cramer, P
影响因子：
56.9
作者：
Cramer, P;Bushnell, DA;Kornberg, RD
通讯作者：
Kornberg, RD
影响因子：
3.5
作者：
Boeger, H;Bushnell, DA;Kornberg, RD
通讯作者：
Kornberg, RD
影响因子：
2.9
作者：
Mestas, Santano P.;Sholders, Aaron J.;Peersen, Olve B.
通讯作者：
Peersen, Olve B.
影响因子：
56.9
作者：
Cramer, P;Bushnell, DA;Kornberg, RD
通讯作者：
Kornberg, RD