A Targeted and Tuneable DNA Damage Tool Using CRISPR/Cas9.
A Targeted and Tuneable DNA Damage Tool Using CRISPR/Cas9.
复制标题
使用CRISPR/Cas9的目标和可调的DNA损伤工具。
DOI：
10.3390/biom11020288
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发表时间：
2021-02-15
期刊：
影响因子：
5.5
通讯作者：
Toseland CP
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Emmanouilidis I;Fili N;Cook AW;Hari-Gupta Y;Dos Santos Á;Wang L;Martin-Fernandez ML;Ellis PJI;Toseland CP
哺乳动物细胞不断遭受各种 DNA 损伤事件，导致 DNA 修复途径激活。了解 DNA 损伤反应的分子机制有助于开发针对这些途径元件的治疗方法。双链断裂 (DSB) 对细胞活力和基因组稳定性特别有害。通常，DSB 修复是使用 DNA 损伤剂（例如电离辐射或基因毒性药物）来研究的。这些会在不可预测的基因组位点引起随机损伤，其中损伤剂量难以控制。此类干预措施不适合研究与局部染色质状态相关的特定 DSB 位点如何调用不同的 DNA 损伤识别和修复途径。 RNA 引导的 Cas9（CRISPR 相关蛋白 9）核酸内切酶是介导靶向基因组改变的强大工具。基于 Cas9 的基因组干预是通过在感兴趣的基因组区域形成 DSB 来实现的。在这里，我们利用基于计算机预测的定制设计的混杂指导 RNA，在整个人类基因组中诱导特定数量和位置的 DSB。这是通过重组 Cas9 引导复合物的电穿孔实现的，该复合物提供了一种通用、低成本且快速的方法，用于在细胞培养模型中诱导受控 DNA 损伤。
Mammalian cells are constantly subjected to a variety of DNA damaging events that lead to the activation of DNA repair pathways. Understanding the molecular mechanisms of the DNA damage response allows the development of therapeutics which target elements of these pathways. Double-strand breaks (DSB) are particularly deleterious to cell viability and genome stability. Typically, DSB repair is studied using DNA damaging agents such as ionising irradiation or genotoxic drugs. These induce random lesions at non-predictive genome sites, where damage dosage is difficult to control. Such interventions are unsuitable for studying how different DNA damage recognition and repair pathways are invoked at specific DSB sites in relation to the local chromatin state. The RNA-guided Cas9 (CRISPR-associated protein 9) endonuclease enzyme is a powerful tool to mediate targeted genome alterations. Cas9-based genomic intervention is attained through DSB formation in the genomic area of interest. Here, we have harnessed the power to induce DSBs at defined quantities and locations across the human genome, using custom-designed promiscuous guide RNAs, based on in silico predictions. This was achieved using electroporation of recombinant Cas9-guide complex, which provides a generic, low-cost and rapid methodology for inducing controlled DNA damage in cell culture models.
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