Labeled EF-Tus for rapid kinetic studies of pretranslocation complex formation.
Labeled EF-Tus for rapid kinetic studies of pretranslocation complex formation.
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DOI：
10.1021/cb500409y
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发表时间：
2014-10-17
影响因子：
4
通讯作者：
Cooperman, Barry S.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Liu, Wei;Kavaliauskas, Darius;Schrader, Jared M.;Poruri, Kiran;Birkedal, Victoria;Goldman, Emanuel;Jakubowski, Hieronim;Mandecki, Wlodek;Uhlenbeck, Olke C.;Knudsen, Charlotte R.;Goldman, Yale E.;Cooperman, Barry S.
普遍保守的翻译延伸因子EF-Tu以aa-tRNA·EF-Tu·GTP三元复合物（TC）的形式将氨酰基（aa）-tRNA递送至核糖体，在核糖体中其与核糖体A位点内的同源mRNA密码子结合，导致形成易位前（PRE）复合物。在这里，我们描述了在翻译延伸中起作用的变体E348 C-EF-Tu的QSY 9和Cy 5衍生物的制备。连同荧光团衍生物的aa-tRNA和核糖体蛋白L11，位于GT3相关的中心（GAC），这些标记的EF-Tus允许开发两个新的FRET检测，允许EF-Tu和L11（Tu-L11测定）和aa-tRNA（Tu-tRNA测定）之间的距离变化的动态解码过程中确定。我们使用这些试验来检查：（i）EF-Tu在解码过程中远离GAC和aa-tRNA移动的相对速率，（ii）误读诱导抗生素链霉素和巴龙霉素对A位点tRNA选择的影响，以及（iii）加强aa-tRNA与EF-Tu的结合如何影响EF-Tu远离核糖体上L11的移动速率。这些FRET测定具有适用于核糖体抗生素的高通量筛选的潜力。
The universally conserved translation elongation factor EF-Tu delivers aminoacyl(aa)-tRNA in the form of an aa-tRNA·EF-Tu·GTP ternary complex (TC) to the ribosome where it binds to the cognate mRNA codon within the ribosomal A-site, leading to formation of a pretranslocation (PRE) complex. Here we describe preparation of QSY9 and Cy5 derivatives of the variant E348C-EF-Tu that are functional in translation elongation. Together with fluorophore derivatives of aa-tRNA and of ribosomal protein L11, located within the GTPase associated center (GAC), these labeled EF-Tus allow development of two new FRET assays that permit the dynamics of distance changes between EF-Tu and both L11 (Tu-L11 assay) and aa-tRNA (Tu-tRNA assay) to be determined during the decoding process. We use these assays to examine: (i) the relative rates of EF-Tu movement away from the GAC and from aa-tRNA during decoding, (ii) the effects of the misreading-inducing antibiotics streptomycin and paromomycin on tRNA selection at the A-site, and (iii) how strengthening the binding of aa-tRNA to EF-Tu affects the rate of EF-Tu movement away from L11 on the ribosome. These FRET assays have the potential to be adapted for high throughput screening of ribosomal antibiotics.
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影响因子：
16.6
作者：
通讯作者：
--
DOI：
10.1016/j.bbapap.2011.02.007
发表时间：
2011-05-01
影响因子：
3.2
作者：
De Laurentiis, Evelina Ines;Mo, Fan;Wieden, Hans-Joachim
通讯作者：
Wieden, Hans-Joachim
影响因子：
14.9
作者：
Jonstrup AT;Andersen KR;Van LB;Brodersen DE
通讯作者：
Brodersen DE
影响因子：
14.9
作者：
Chiu, J;March, PE;Tillett, D
通讯作者：
Tillett, D
影响因子：
4.5
作者：
Pan, Dongli;Qin, Haiou;Cooperman, Barry S.
通讯作者：
Cooperman, Barry S.