Improved isolation strategies to increase the yield and purity of human urinary exosomes for biomarker discovery.
Improved isolation strategies to increase the yield and purity of human urinary exosomes for biomarker discovery.
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DOI：
10.1038/s41598-018-22142-x
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发表时间：
2018-03-02
影响因子：
4.6
通讯作者：
Monastyrskaya K
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Gheinani AH;Vögeli M;Baumgartner U;Vassella E;Draeger A;Burkhard FC;Monastyrskaya K
在细胞外空间和体液如尿液中检测到循环miRNA。循环RNA可以被包装在分泌的尿细胞外囊泡（uEV）中，从而免受降解。尿外泌体制剂可能含有特异性miRNA，作为肾脏和膀胱疾病的相关生物标志物。将uEV应用于临床环境的主要困难是uEV分离方法的高变异性和低再现性。在这里，我们使用了五种不同的方法来分离uEV，并比较了uEV的大小分布，形态，产量，外泌体蛋白标记物的存在和RNA含量。我们提出了一种优化的超离心和尺寸排阻色谱方法，用于从50 ml尿液中高度可重复地分离50-150 nm的uEV，对应于外泌体。我们用NanoString平台分析了来自相同样品的uEV和总尿液的miRNA含量，并使用qPCR验证了数据。我们的结果表明，在uEV中稳健检测到的18种miRNAs始终存在于总尿液中。然而，15种miRNA仅可在总尿液制备物中检测到，并且可能代表裸循环miRNA种类。这是用于uEV分离、含量标准化和miRNA货物分析的新的无偏倚和可重复的策略，适用于生物标志物发现研究。
Circulating miRNAs are detected in extracellular space and body fluids such as urine. Circulating RNAs can be packaged in secreted urinary extracellular vesicles (uEVs) and thus protected from degradation. Urinary exosome preparations might contain specific miRNAs, relevant as biomarkers in renal and bladder diseases. Major difficulties in application of uEVs into the clinical environment are the high variability and low reproducibility of uEV isolation methods. Here we used five different methods to isolate uEVs and compared the size distribution, morphology, yield, presence of exosomal protein markers and RNA content of uEVs. We present an optimized ultracentrifugation and size exclusion chromatography approach for highly reproducible isolation for 50–150 nm uEVs, corresponding to the exosomes, from 50 ml urine. We profiled the miRNA content of uEVs and total urine from the same samples with the NanoString platform and validated the data using qPCR. Our results indicate that 18 miRNAs, robustly detected in uEVs were always present in the total urine. However, 15 miRNAs could be detected only in the total urine preparations and might represent naked circulating miRNA species. This is a novel unbiased and reproducible strategy for uEVs isolation, content normalization and miRNA cargo analysis, suitable for biomarker discovery studies.
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Kuo WP
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期刊：
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA
影响因子：
--
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