An In Vitro Assay for Substrate Translocation by FhaC in Liposomes.
An In Vitro Assay for Substrate Translocation by FhaC in Liposomes.
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脂质体中 FhaC 底物易位的体外测定
DOI：
10.1007/978-1-4939-2871-2_8
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发表时间：
2015
影响因子：
--
通讯作者：
Matthias Müller
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Enguo Fan;Derrick Norell;Matthias Müller
革兰氏阴性菌利用双配偶体分泌（TPS）途径分泌一个大家族的毒力外蛋白。它的名字来源于它涉及两种蛋白质的事实，即分泌的TpsA蛋白和外膜中的同源TpsB转运蛋白。典型的TPS系统由百日咳杆菌的丝状血凝素FhaB（TpsA蛋白）及其转运蛋白FhaC（TpsB蛋白）代表。从突变分析和异源表达实验的结果表明，FhaC是必需的FhaB易位穿过细菌的外膜。我们已经设计了一种无细胞的生化测定，以在体外重建的易位FhaB到重建的膜囊泡。因此，已经提供了最清楚的证据，即单个β-桶FhaC蛋白作为唯一的转运蛋白将FhaB转运穿过外膜。这是第一次在体外测定蛋白质分泌跨越theherichia coliouter膜和详细的协议，这里描述的应服从修改和应用程序的分析发生在革兰氏阴性菌的外膜相关的蛋白质转运事件。
The two-partner secretion (TPS) pathway is used by gram-negative bacteria to secrete a large family of virulence exoproteins. Its name is derived from the fact that it involves two proteins, a secreted TpsA protein and a cognate TpsB transporter in the outer membrane. A typical TPS system is represented by the filamentous hemagglutinin FhaB (TpsA protein) and its transporter FhaC (TpsB protein) ofBordetella pertussis. Results from mutational analysis and heterologous expression experiments suggested that FhaC is essential for FhaB translocation across the outer membrane of bacteria. We have devised a cell-free biochemical assay to reconstitute in vitro the translocation of FhaB into reconstituted membrane vesicles. Thereby the clearest evidence has been provided that the single β-barrel FhaC protein serves as the sole translocator to transport FhaB across the outer membrane. This is the first in vitro assay for protein secretion across theEscherichia coliouter membrane and the detailed protocol described here should be amenable to modifications and application to the analysis of related protein transport events occurring at the outer membranes of gram-negative bacteria.
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