Electron-transferring flavoprotein from pig kidney: flavin analogue studies.
Electron-transferring flavoprotein from pig kidney: flavin analogue studies.
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来自猪肾的电子传递黄素蛋白：黄素类似物研究。
DOI：
10.1021/bi00370a050
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发表时间：
1986
期刊：
影响因子：
2.9
通讯作者：
Thorpe,C
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Gorelick,RJ;Thorpe,C
特拉华州纽瓦克特拉华大学化学系，1986年4月11日收到；1986年7月30日收到修订稿件摘要：用酸性硫酸铵法制备了猪肾载脂蛋白电子转移黄素蛋白(apo-ETF)，并与FAD类似物重组以探测黄素结合部位。通过8-氯-FAD-ETF与硫化钠和硫酚的反应判断，结合的黄素的8位是溶剂可及的。一系列含有越来越大的取代基的8-烷基硫醇-FAD类似物与apo-ETF紧密结合，并可以在中等链酰-CoA脱氢酶的催化水平下被辛酰辅酶A还原到二氢黄素水平。体积庞大的取代物严重减慢了这些黄素间电子转移反应的速度。在8-环己基硫醇衍生物的情况下，这一下降反映了ETF的Km大幅增加(约14倍)，而Fmax仅下降了20%。所有这些8-取代衍生物的还原都涉及ETF阴离子自由基中间体的积累。与相应的1-脱氮黄素取代不同，二氢-5-脱氮-FAD脱氢酶不能还原天然ETF，尽管存在非常有利的氧化还原电势差。这些结果，加上来自天然蛋白质的数据，与脱氢酶和ETF之间强制性的1电子转移是一致的，可能涉及ETF暴露的二甲苯边缘。用光亲和类似物8-叠氮黄素重组的apo-ETF照射后，黄素的共价掺入约为10%。用8-叠氮基-FAD氚标记的apo-ETF的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法显示，较小的亚基(88%，MT 30000亚基；12%，MT 33000亚基)有较好的标记。这些数据表明，ETF的较小亚基可能至少包括这个异二聚体电子受体中的黄素结合位点的一部分。哺乳动物电子转移黄素蛋白[ETF1(Crane&Beinert，1956)]是一种相当罕见的电子载体。首先，它是由不同亚基组成的二聚体，每个二聚体含有一个FAD分子(Furuta等人，1981；Gorelick等人，1982；McKean等人，1983；Husain和Steenkamp，1983)。其次，它从几个线粒体中收集还原等价物
Department of Chemistry, University of Delaware, Newark, Delaware 19716 Received April 11, 1986; Revised Manuscript Received July 30, 1986 abstract: Apo-electron-transferring flavoprotein from pig kidney (apo-ETF) has been prepared by an acid ammonium sulfate procedure and reconstituted with FAD analogues to probe the flavin binding site. The8-position of the bound flavin is accessible to solvent as judged by the reaction of 8-C1-FAD-ETF with sodium sulfide and thiophenol. A series of 8-alkylmercapto-FAD analogues containing increasingly bulky substituents bind tightly to apo-ETF and can be reduced to the dihydroflavin level by octanoyl-CoA in the presence of catalytic levels of the medium-chainacyl-CoA dehydrogenase. Bulky substituentsseverely slow the rate of these interflavin electron-transfer reactions. In the case of the 8-cyclohexyImercapto derivative, this decrease reflects a sizable increase in the Km for ETF (approximately 14-fold) with only a 20% decrease in Fmax. Reduction of all of these 8-substituted derivatives involves the accumulation of ETF anion radical inter-mediates. Dihydro-5-deaza-FAD dehydrogenase, unlike the corresponding 1-deazaflavin substitution, is unable to reduce native ETF despite a strongly favorable redox potential difference. These results, together with data from the native proteins, are consistent with obligatory 1-electron transfer between dehydrogenase and ETF possibly involving the exposed dimethylbenzene edge of ETF. Irradiation of apo-ETF reconstituted with the photoaffinity analogue 8-azidoflavin leads to approximately 10% covalent incorporation of the flavin. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of apo-ETF labeled with tritiated 8-azido-FAD shows preferential labeling of the smaller subunit (88%, MT 30000 subunit; 12%, Mt 33 000 subunit). These data suggest that the smaller subunit of ETF may comprise at least part of the flavin binding site in this heterodimeric electron acceptor. jMammalian electron-transferring flavoprotein [ETF1 (Crane & Beinert, 1956)] is a rather unusual electron carrier. First, it is a dimer of dissimilar subunits containing one FAD molecule per dimer (Furuta et al., 1981; Gorelick et al., 1982; McKean et al., 1983; Husain & Steenkamp, 1983). Second, it collects reducing equivalents from several mitochondrial
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--
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