Protocol to prepare doubly labeled fluorescent nucleosomes for single-molecule fluorescence microscopy.
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DOI：
10.1016/j.xpro.2023.102229
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发表时间：
2023-04-19
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Musselman, Catherine A.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Ghoneim, Mohamed;Musselman, Catherine A.
单分子荧光显微镜（SMFM）已被证明是了解染色质相关因子与核小体，染色质的基本构建单位的相互作用的信息。在这里，我们提出了一个方案，用于制备双标记的荧光核小体SMFM。我们描述了在大肠杆菌中过表达和纯化重组人核心组蛋白的步骤。然后，我们详细的荧光标记的组蛋白和核小体双链DNA的八聚体重折叠和核小体重建。重组人核心组蛋白在大肠杆菌中的过表达和纯化组蛋白的位点特异性荧光标记基于PCR的核小体DNA的位点特异性标记荧光八聚体的重折叠和荧光核小体的重建出版商说明：进行任何实验方案都需要遵守当地机构的实验室安全和伦理指南。单分子荧光显微镜（SMFM）已被证明是了解染色质相关因子与核小体，染色质的基本构建单位的相互作用的信息。在这里，我们提出了一个方案，用于制备双标记的荧光核小体SMFM。我们描述了在大肠杆菌中过表达和纯化重组人核心组蛋白的步骤。然后，我们详细的荧光标记的组蛋白和核小体双链DNA的八聚体重折叠和核小体重建。
Single-molecule fluorescence microscopy (SMFM) has been shown to be informative in understanding the interaction of chromatin-associated factors with nucleosomes, the basic building unit of chromatin. Here, we present a protocol for preparing doubly labeled fluorescent nucleosomes for SMFM. We describe steps for over-expression in E. coli and purification of recombinant human core histones. We then detail fluorescent labeling of histones and nucleosomal double-stranded DNA followed by octamer refolding and nucleosome reconstitution. Over-expression in E. coli and purification of recombinant human core histones Site-specific fluorescent labeling of histones PCR-based site-specific labeling of nucleosomal DNA Refolding of fluorescent octamer and reconstitution of fluorescent nucleosome Publisher’s note: Undertaking any experimental protocol requires adherence to local institutional guidelines for laboratory safety and ethics. Single-molecule fluorescence microscopy (SMFM) has been shown to be informative in understanding the interaction of chromatin-associated factors with nucleosomes, the basic building unit of chromatin. Here, we present a protocol for preparing doubly labeled fluorescent nucleosomes for SMFM. We describe steps for over-expression in E. coli and purification of recombinant human core histones. We then detail fluorescent labeling of histones and nucleosomal double-stranded DNA followed by octamer refolding and nucleosome reconstitution.
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