Tailored Cofactor Traps for the in Situ Detection of Hemithioacetal-Forming Pyridoxal Kinases.
Tailored Cofactor Traps for the in Situ Detection of Hemithioacetal-Forming Pyridoxal Kinases.
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用于原位检测半硫缩醛形成吡哆醛激酶的定制辅助因子陷阱
DOI：
10.1021/acschembio.0c00787
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发表时间：
2020
影响因子：
4
通讯作者：
Sieber
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Hübner;Dienemann J.-N;Friederich;Sieber
吡哆醛激酶（PLK）是磷酸吡哆醛生物合成的关键酶，磷酸吡哆醛是多种酶促反应中的重要辅因子。这些酶的进化导致了不同的催化设计。除了活性位点外，最近还证明了嵌入在远处柔性盖区域内的半胱氨酸的重要性。这种半胱氨酸与吡哆醛形成半硫缩醛，对催化作用至关重要。尽管这些酶在各种生物中普遍存在，但还没有工具可用于研究这种盖子残留物的相关性。在这里，我们介绍吡哆醛探针，每个配备有亲电捕获基团的醛的位置，以靶向PLK反应盖半胱氨酸作为半硫缩醛形成的模拟。在吡哆醛结构内的两个不同位置处添加炔柄有利于从活细胞富集PLK。有趣的是，根据位置，探针显示出对革兰氏阳性或革兰氏阴性PLK富集的偏好。通过应用辅因子陷阱，我们不仅能够验证先前研究的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌PLKs，而且还能够验证大肠杆菌和铜绿假单胞菌PLKs，从而揭示了盖子半胱氨酸在催化中的关键作用。总的来说，我们定制的探针促进了含Lid半胱氨酸的PLK的可靠读出，使其有资格作为挖掘这一重要酶类的进一步多样化蛋白质组的化学工具。
Pyridoxal kinases (PLK) are crucial enzymes for the biosynthesis of pyridoxal phosphate, an important cofactor in a plethora of enzymatic reactions. The evolution of these enzymes resulted in different catalytic designs. In addition to the active site, the importance of a cysteine, embedded within a distant flexible lid region, was recently demonstrated. This cysteine forms a hemithioacetal with the pyridoxal aldehyde and is essential for catalysis. Despite the prevalence of these enzymes in various organisms, no tools were yet available to study the relevance of this lid residue. Here, we introduce pyridoxal probes, each equipped with an electrophilic trapping group in place of the aldehyde to target PLK reactive lid cysteines as a mimic of hemithioacetal formation. The addition of alkyne handles placed at two different positions within the pyridoxal structure facilitates enrichment of PLKs from living cells. Interestingly, depending on the position, the probes displayed a preference for either Gram-positive or Gram-negative PLK enrichment. By applying the cofactor traps, we were able to validate not only previously investigatedStaphylococcus aureusandEnterococcus faecalisPLKs but alsoEscherichia coliandPseudomonas aeruginosaPLKs, unravelling a crucial role of the lid cysteine for catalysis. Overall, our tailored probes facilitated a reliable readout of lid cysteine containing PLKs, qualifying them as chemical tools for mining further diverse proteomes for this important enzyme class.
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