Advanced Methods for the Investigation of Cell Contact Dynamics in Endothelial Cells Using Florescence-Based Live Cell Imaging
Advanced Methods for the Investigation of Cell Contact Dynamics in Endothelial Cells Using Florescence-Based Live Cell Imaging
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使用基于荧光的活细胞成像研究内皮细胞中细胞接触动力学的先进方法
DOI：
10.1159/000494933
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发表时间：
2018
影响因子：
1.7
通讯作者：
Schnittler
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Schimp;Seebach;Aldirawi;Schnittler
血管系统的内皮细胞是动态细胞，其分子适应性对于调节内环境稳定和器官灌注是决定性的。先进的显微技术，自动化处理和图像分析软件被证明可以提高对血管生物学的理解。在这项工作中，我们描述了先进的方法，可以调查内皮细胞接触的动态。病毒载体的发展为内皮细胞的遗传操作做出了重要贡献。我们使用吉布森组件作为一个快速和廉价的克隆系统，将序列引入到基于慢病毒的pFUGW载体。此外，经典的荧光标签，如mCherry和EGFP进行了比较，与自标记标签，如Halo和SNAP的适用性，以研究在培养的内皮细胞的连接动力学，并发现自标记标签作为有用的工具。使用这样的组合，我们发现保持细胞连接的完整性，在剪切应力诱导的连接重建使用VE-钙粘蛋白-EGFP。重构伴随着VE-钙粘蛋白斑块的形成，表明这一过程是由肌动蛋白驱动的连接相关间歇性板状伪足（JAIL）的形成介导的。包括吉布森组装、慢病毒介导的基因转移、基于转盘的活细胞成像和定量软件的组合方法允许在静态和剪切应力条件下分析内皮细胞连接动力学。
Endothelial cells of the vascular system are dynamic cells whose molecular adaptability is decisive for the adjustment of homeostasis and organ perfusion. Advanced microscopic techniques, automation processing, and image analysis software was shown to improve the understanding of vascular biology. In this work, we describe advanced methods that allow investigating the dynamics of endothelial cell contacts. The development of viral vectors has contributed significantly to the genetic manipulation of endothelial cells. We used the Gibson assembly as a quick and cheap cloning system for introducing sequences into the lentiviral-based pFUGW vector. Furthermore, classical fluorescence tags such as mCherry and EGFP were compared with self-labeling tags such as Halo and SNAP for their suitability to study junction dynamics in cultured endothelium, and found the self-labeling tags as useful tools. Using such combinations, we found maintained cell junction integrity during shear stress-induced junction remodeling using VE-cadherin-EGFP. Remodeling was accompanied by VE-cadherin plaque formation, indicating that this process is mediated by the for-mation of the actin-driven junction-associated intermittent lamellipodia, JAIL. The combined methods including the Gibson assembly, lentiviral mediated gene transfer, spinning disk-based live cell imaging, and software for quantification allow analyses of the endothelial cell junction dynamics under static and under shear stress conditions.
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DOI：
--
发表时间：
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Discoveries
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H. Schnittler
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J. Seebach;H. Mädler;B. Wojciak-Stothard;H. Schnittler
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--
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