Complementary Steric Engineering at the Protein-Ligand Interface for Analogue-Sensitive TET Oxygenases.
Complementary Steric Engineering at the Protein-Ligand Interface for Analogue-Sensitive TET Oxygenases.
复制标题
用于模拟敏感的TET氧酶的蛋白质配体界面的互补空间工程。
DOI：
10.1021/jacs.8b05283
复制
发表时间：
2018-08-15
影响因子：
15
通讯作者：
Islam K
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Sudhamalla B;Wang S;Snyder V;Kavoosi S;Arora S;Islam K
10 - 11易位（泰特）酶利用O2、地球上丰富的铁和2-酮戊二酸（2KG）来进行DNA中5-甲基胞嘧啶的反复C-H氧化以控制哺乳动物基因组的表达。鉴于人类中存在超过60种这样的C-H加氧酶，确定这些酶中每一种的上下文依赖性功能是一个关键的挑战。为了解决这个问题，我们开发了类似物敏感的泰特酶来干扰特定成员的活性。我们合理地设计了TET 2 -2KG界面，以开发具有扩展的活性位点的TET 2变体，该活性位点可以被携带互补空间“凸起”的N-草酰甘氨酸（NOG）衍生物特异性抑制。在这里，我们描述了一个庞大的看门人残留物的泰特蛋白的鉴定和工程，表征的正交muffins抑制剂对，并显示该方法的一般性。采用细胞可渗透的NOG类似物，我们表明TET 2突变体可以被特异性抑制，以有条件地调节完整人类细胞中染色体DNA中的胞嘧啶甲基化。最后，我们展示了正交突变体-抑制剂对探测细胞中特定泰特成员的转录活性的应用。我们的工作提供了一个通用的平台，开发模拟敏感的2KG依赖性加氧酶，以解开他们在不同的信号转导过程中的功能。
Ten-eleven translocation (TET) enzymes employ O2, earth-abundant iron, and 2-ketoglutarate (2KG) to perform iterative C–H oxidation of 5-methylcytosine in DNA to control expression of the mammalian genome. Given that more than 60 such C–H oxygenases are present in humans, determining context-dependent functions of each of these enzymes is a pivotal challenge. In an effort to tackle the problem, we developed analogue-sensitive TET enzymes to perturb the activity of a specific member. We rationally engineered the TET2–2KG interface to develop TET2 variants with an expanded active site that can be specifically inhibited by the N-oxalylglycine (NOG) derivatives carrying a complementary steric “bump”. Herein, we describe the identification and engineering of a bulky gatekeeper residue for TET proteins, characterize the orthogonal mutant–inhibitor pairs, and show generality of the approach. Employing cell-permeable NOG analogues, we show that the TET2 mutant can be specifically inhibited to conditionally modulate cytosine methylation in chromosomal DNA in intact human cells. Finally, we demonstrate application of the orthogonal mutant–inhibitor pair to probe transcriptional activity of a specific TET member in cells. Our work provides a general platform for developing analogue-sensitive 2KG-dependent oxygenases to unravel their functions in diverse signaling processes.
登录
查看更多内容
影响因子：
15
作者：
Lee M;Li J;Liang Y;Ma G;Zhang J;He L;Liu Y;Li Q;Li M;Sun D;Zhou Y;Huang Y
通讯作者：
Huang Y
DOI：
10.1126/science.1249830
发表时间：
2014-10-31
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Baud MGJ;Lin-Shiao E;Cardote T;Tallant C;Pschibul A;Chan KH;Zengerle M;Garcia JR;Kwan TT;Ferguson FM;Ciulli A
通讯作者：
Ciulli A
影响因子：
15
作者：
Lin, Q;Jiang, FY;Gray, NS
通讯作者：
Gray, NS
影响因子：
4.8
作者：
Coulter, Jonathan B.;O'Driscoll, Cliona M.;Bressler, Joseph P.
通讯作者：
Bressler, Joseph P.
影响因子：
5.7
作者：
Krishnan, Swathi;Trievel, Raymond C.
通讯作者：
Trievel, Raymond C.