Selective methyl labeling of eukaryotic membrane proteins using cell-free expression.
Selective methyl labeling of eukaryotic membrane proteins using cell-free expression.
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DOI：
10.1021/ja504791j
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发表时间：
2014-08-13
影响因子：
15
通讯作者：
Wagner, Gerhard
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Linser, Rasmus;Gelev, Vladimir;Hagn, Franz;Arthanari, Haribabu;Hyberts, Sven G.;Wagner, Gerhard
使用 NMR 对膜蛋白和其他大蛋白进行结构表征越来越依赖于全氘化与特定质子化氨基酸部分（例如异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸的甲基）的掺入相结合。由此产生的质子稀释减少了偶极展宽，产生更尖锐的共振线，改善光谱拥挤，并能够测量甲基之间和甲基之间的关键距离。虽然现在已经很好地建立了使用合适的前体进行细菌表达的特定甲基标记的结合，但仍然缺乏相应的无细胞表达方法，而无细胞表达通常是生产毫克量的标记真核膜蛋白的唯一选择。在这里，我们表明，我们可以通过基于粗水解 ILV 标记的 OmpX 包涵体的无细胞表达，经济高效地表达甲基标记的人整合膜蛋白。这些是在大肠杆菌中大量获得的，代表了将 ILV 前体导入真核蛋白质的最佳中间体。
Structural characterization of membrane proteins and other large proteins with NMR relies increasingly on perdeuteration combined with incorporation of specifically protonated amino acid moieties, such as methyl groups of isoleucines, valines, or leucines. The resulting proton dilution reduces dipolar broadening producing sharper resonance lines, ameliorates spectral crowding, and enables measuring of crucial distances between and to methyl groups. While incorporation of specific methyl labeling is now well established for bacterial expression using suitable precursors, corresponding methods are still lacking for cell-free expression, which is often the only choice for producing labeled eukaryotic membrane proteins in mg quantities. Here we show that we can express methyl-labeled human integral membrane proteins cost-effectively by cell-free expression based of crude hydrolyzed ILV-labeled OmpX inclusion bodies. These are obtained in Escherichia coli with very high quantity and represent an optimal intermediate to channel ILV precursors into the eukaryotic proteins.
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DOI：
10.1073/pnas.0407792102
发表时间：
2005-01-18
影响因子：
11.1
作者：
Tugarinov, V;Choy, WY;Kay, LE
通讯作者：
Kay, LE
影响因子：
15
作者：
Tugarinov, V;Sprangers, R;Kay, LE
通讯作者：
Kay, LE
影响因子：
2.7
作者：
Wu, PSC;Ozawa, K;Otting, G
通讯作者：
Otting, G
影响因子：
16.6
作者：
May, Sylvia;Andreasson-Ochsner, Mirjam;Sinner, Eva-Kathrin
通讯作者：
Sinner, Eva-Kathrin
影响因子：
4.8
作者：
Duncan, EA;Davé, UP;Brown, MS
通讯作者：
Brown, MS