Measurement of deaminated cytosine adducts in DNA using a novel hybrid thymine DNA glycosylase.
Measurement of deaminated cytosine adducts in DNA using a novel hybrid thymine DNA glycosylase.
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DOI：
10.1016/j.jbc.2022.101638
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发表时间：
2022-03
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Sowers LC
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Hsu CW;Sowers ML;Baljinnyam T;Herring JL;Hackfeld LC;Tang H;Zhang K;Sowers LC
胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的水解脱氨基作用驱动了在人类癌症中观察到的许多过渡突变。脱氨诱导的诱变中间体包括与鸟嘌呤错配的尿嘧啶或胸腺嘧啶加合物。虽然存在大量方法来测量其他类型的 DNA 加合物，但胞嘧啶脱氨加合物造成了不寻常的分析问题，并且尚未开发出足够的方法来测量它们。我们在这里描述了一种新型杂合胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG），它由来自人类TDG的29个氨基酸序列组成，该序列与古菌嗜热细菌中发现的胸腺嘧啶糖基化酶的催化结构域连接。使用确定序列的寡核苷酸，我们证明杂合 TDG 对脱氨基 U:G 和 T:G 错配具有强大的错配选择性活性。我们进一步开发了一种从寡核苷酸和 DNA 中分离糖基化酶释放的游离碱基，然后进行 GC-MS/MS 定量的方法。使用这种方法，我们首次测量了小牛胸腺 DNA 中总尿嘧啶、U:G 和 T:G 对的水平。这里介绍的方法将允许测量一类生物学上重要的脱氨基胞嘧啶加合物的形成、持久性和修复。
The hydrolytic deamination of cytosine and 5-methylcytosine drives many of the transition mutations observed in human cancer. The deamination-induced mutagenic intermediates include either uracil or thymine adducts mispaired with guanine. While a substantial array of methods exist to measure other types of DNA adducts, the cytosine deamination adducts pose unusual analytical problems, and adequate methods to measure them have not yet been developed. We describe here a novel hybrid thymine DNA glycosylase (TDG) that is comprised of a 29-amino acid sequence from human TDG linked to the catalytic domain of a thymine glycosylase found in an archaeal thermophilic bacterium. Using defined-sequence oligonucleotides, we show that hybrid TDG has robust mispair-selective activity against deaminated U:G and T:G mispairs. We have further developed a method for separating glycosylase-released free bases from oligonucleotides and DNA followed by GC–MS/MS quantification. Using this approach, we have measured for the first time the levels of total uracil, U:G, and T:G pairs in calf thymus DNA. The method presented here will allow the measurement of the formation, persistence, and repair of a biologically important class of deaminated cytosine adducts.
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