CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells.
CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells.
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DOI：
10.1038/nprot.2017.143
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发表时间：
2018-03
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
Porteus MH
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Bak RO;Dever DP;Porteus MH
在人类造血干细胞（HSC）中通过同源重组（HR）（基因靶向）进行基因组编辑，能够揭示基因功能关系，并可能改变治愈性血液基因和细胞疗法。然而，没有全面和可重复的方案来靶向HSC用于HR。在本文中，我们提供了通过将CRISPR/Cas9技术与使用rAAV 6和流式细胞术相结合来产生、富集以及体外和体内分析HR靶向HSC的详细方案。使用该协议，研究人员可以将单核苷酸变化引入基因组或更长的基因盒中，具有基因组编辑的精度。沿着我们的故障排除和优化指南，研究人员可以使用该方案来简化任何感兴趣位点的HSC基因组编辑。体外HSC靶向方案和分析可在3周内完成，免疫缺陷小鼠中的长期体内HSC植入分析可在16周内实现。该方案能够操纵基因，以研究造血过程中的基因功能，以及用于校正基于HSC移植的疾病治疗（如镰状细胞病、β-地中海贫血和原发性免疫缺陷）中的基因突变。
Genome editing via homologous recombination (HR) (gene targeting) in human hematopoietic stem cells (HSCs) has the power to reveal gene–function relationships and potentially transform curative hematological gene and cell therapies. However, there are no comprehensive and reproducible protocols for targeting HSCs for HR. Herein, we provide a detailed protocol for the production, enrichment, and in vitro and in vivo analyses of HR-targeted HSCs by combining CRISPR/Cas9 technology with the use of rAAV6 and flow cytometry. Using this protocol, researchers can introduce single-nucleotide changes into the genome or longer gene cassettes with the precision of genome editing. Along with our troubleshooting and optimization guidelines, researchers can use this protocol to streamline HSC genome editing at any locus of interest. The in vitro HSC-targeting protocol and analyses can be completed in 3 weeks, and the long-term in vivo HSC engraftment analyses in immunodeficient mice can be achieved in 16 weeks. This protocol enables manipulation of genes for investigation of gene functions during hematopoiesis, as well as for the correction of genetic mutations in HSC transplantation–based therapies for diseases such as sickle cell disease, β-thalassemia, and primary immunodeficiencies.
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影响因子：
8.8
作者：
Gundry MC;Brunetti L;Lin A;Mayle AE;Kitano A;Wagner D;Hsu JI;Hoegenauer KA;Rooney CM;Goodell MA;Nakada D
通讯作者：
Nakada D
影响因子：
64.8
作者：
Genovese, Pietro;Schiroli, Giulia;Escobar, Giulia;Di Tomaso, Tiziano;Firrito, Claudia;Calabria, Andrea;Moi, Davide;Mazzieri, Roberta;Bonini, Chiara;Holmes, Michael C.;Gregory, Philip D.;van der Burg, Mirjam;Gentner, Bernhard;Montini, Eugenio;Lombardo, Angelo;Naldini, Luigi
通讯作者：
Naldini, Luigi
影响因子：
14.8
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
64.8
作者：
Barzel, A.;Paulk, N. K.;Shi, Y.;Huang, Y.;Chu, K.;Zhang, F.;Valdmanis, P. N.;Spector, L. P.;Porteus, M. H.;Gaensler, K. M.;Kay, M. A.
通讯作者：
Kay, M. A.
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作者：
Hendel A;Bak RO;Clark JT;Kennedy AB;Ryan DE;Roy S;Steinfeld I;Lunstad BD;Kaiser RJ;Wilkens AB;Bacchetta R;Tsalenko A;Dellinger D;Bruhn L;Porteus MH
通讯作者：
Porteus MH