Optimized CRISPR-Cpf1 system for genome editing in zebrafish.
Optimized CRISPR-Cpf1 system for genome editing in zebrafish.
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DOI：
10.1016/j.ymeth.2018.06.014
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发表时间：
2018-11-01
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Moreno-Mateos MA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Fernandez JP;Vejnar CE;Giraldez AJ;Rouet R;Moreno-Mateos MA
CRISPR-Cas9系统的生物技术影响最近扩大了可用于不同模式生物的基因组编辑工具箱，进一步增加了新的高效CRISPR核酸内切酶。我们最近在斑马鱼中优化了CRISPR-Cpf 1（重命名为Cas 12 a）系统。我们发现，i）在不存在Cpf 1蛋白的情况下，crRNA在体内不稳定并降解，CRISPR-Cpf 1 RNP复合物有效地诱变斑马鱼基因组; ii）温度调节Cpf 1活性，特别是影响AsCpf 1，其在低于37°C时表现降低。在这里，我们描述了一个循序渐进的协议，如何容易地设计和产生crRNA在体外，纯化重组Cpf 1蛋白，并组装核糖核蛋白复合物进行有效的诱变在斑马鱼中的组成和温度控制的方式。最后，我们解释了如何诱导Cpf 1介导的同源定向修复使用单链DNA寡核苷酸。总之，该方案包括使用CRISPR-Cpf 1系统有效修饰斑马鱼基因组和其他变温生物的步骤。
The CRISPR-Cas9 system biotechnological impact has recently broadened the genome editing toolbox available to different model organisms further with the addition of new efficient CRISPR-based endonucleases. We have recently optimized CRISPR-Cpf1 (renamed Cas12a) system in zebrafish. We showed that i) in the absence of Cpf1 protein, crRNAs are unstable and degraded in vivo, and CRISPR-Cpf1 RNP complexes efficiently mutagenize the zebrafish genome; and ii) temperature modulates Cpf1 activity especially affecting AsCpf1, which experiences a reduced performance below 37°C. Here, we describe a step-by-step protocol on how to easily design and generate crRNAs in vitro, purify recombinant Cpf1 proteins, and assemble ribonucleoprotein complexes to carry out efficient mutagenesis in zebrafish in a constitutive and temperature-controlled manner. Finally, we explain how to induce Cpf1-mediated homology-directed repair using single-stranded DNA oligonucleotides. In summary, this protocol includes the steps to efficiently modify the zebrafish genome and other ectothermic organisms using the CRISPR–Cpf1 system.
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