Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.
Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.
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DOI：
10.1093/nar/gki901
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发表时间：
2005
影响因子：
14.9
通讯作者：
Jaenisch R
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Meissner A;Gnirke A;Bell GW;Ramsahoye B;Lander ES;Jaenisch R
我们描述了一种称为简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）的大规模随机方法，用于分析和比较基因组甲基化模式。 BglII 限制性片段大小选择为 500-600 bp，配备接头，用亚硫酸氢盐处理，PCR 扩增、克隆和测序。我们从鼠 ES 细胞和缺乏 DNA 甲基转移酶 Dnmt3a 和 3b 且 Dnmt1 水平敲低 (kd) 的 ES 细胞 (Dnmt[1kd,3a−/−,3b−/−]) 构建了 RRBS 文库。对来自 Dnmt[1kd,3a−/−,3b−/−] 细胞的 960 个 RRBS 克隆进行测序，生成了 343 kb 的非冗余亚硫酸氢盐序列，覆盖基因组中的 66212 个胞嘧啶。除 38 个胞嘧啶外，所有胞嘧啶均已转化为尿嘧啶，表明转化率 >99.9%。其余的胞嘧啶中，有 35 个在 CpG 二核苷酸中，3 个在 CpT 二核苷酸中。与野生型 ES 细胞相比，非 CpG 甲基化减少了 250 倍以上，这与 Dnmt3a 和/或 Dnmt3b 在 CpA 和 CpT 甲基化中的作用一致。更仔细的检查既没有发现甲基化位点周围的共有序列，也没有发现基因组中残留甲基化聚集的证据。我们的研究结果表明 Dnmt[1kd,3a−/−,3b−/−] 细胞中甲基化的随机丢失而不是特异性维持。接近完全的亚硫酸氢盐转化和 RRBS 文库的基本无偏差表示表明随机鸟枪亚硫酸氢盐测序可以扩展到全基因组方法。
We describe a large-scale random approach termed reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) for analyzing and comparing genomic methylation patterns. BglII restriction fragments were size-selected to 500–600 bp, equipped with adapters, treated with bisulfite, PCR amplified, cloned and sequenced. We constructed RRBS libraries from murine ES cells and from ES cells lacking DNA methyltransferases Dnmt3a and 3b and with knocked-down (kd) levels of Dnmt1 (Dnmt[1kd,3a−/−,3b−/−]). Sequencing of 960 RRBS clones from Dnmt[1kd,3a−/−,3b−/−] cells generated 343 kb of non-redundant bisulfite sequence covering 66212 cytosines in the genome. All but 38 cytosines had been converted to uracil indicating a conversion rate of >99.9%. Of the remaining cytosines 35 were found in CpG and 3 in CpT dinucleotides. Non-CpG methylation was >250-fold reduced compared with wild-type ES cells, consistent with a role for Dnmt3a and/or Dnmt3b in CpA and CpT methylation. Closer inspection revealed neither a consensus sequence around the methylated sites nor evidence for clustering of residual methylation in the genome. Our findings indicate random loss rather than specific maintenance of methylation in Dnmt[1kd,3a−/−,3b−/−] cells. Near-complete bisulfite conversion and largely unbiased representation of RRBS libraries suggest that random shotgun bisulfite sequencing can be scaled to a genome-wide approach.
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