Design and application of a shRNA-based gene replacement retrovirus.
Design and application of a shRNA-based gene replacement retrovirus.
复制标题
基于shRNA的基因替换逆转录病毒的设计和应用。
DOI：
10.1007/978-1-59745-547-3_12
复制
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Ye,Xiaofen
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Zhang,Rugang;Adams,PeterD;Ye,Xiaofen
为了在体内对蛋白质进行结构/功能分析，理想情况下，人们应该能够同时取消内源性野生型蛋白质的表达，用含有目标突变的蛋白质形式代替它，并分析功能后果。直到最近，在哺乳动物系统中，这是一种极具挑战性和/或费力的方法，需要在人类细胞系或小鼠中进行靶向基因敲入。本文描述了一种基于RNA干扰（RNAi）的方法，可以更简单地在哺乳动物细胞中实现这一目标。已经构建了一种逆转录病毒，它指导短发夹RNA （shRNA）的表达，以敲低内源性感兴趣蛋白的表达；编码同一蛋白质的野生型或突变版本的cDNA，也包含“沉默突变”，不影响蛋白质序列，但确实使mRNA对shRNA具有抗性；还有一种抗嘌呤霉素基因，可以让病毒感染的细胞快速选择药物。利用这种病毒，内源性抗沉默功能1a （ASF1a）组蛋白伴侣蛋白的表达在原代人细胞中被异位表达的表位标记版本有效地取代。此外，该病毒的设计使得其他shRNA和shRNA抗性cDNA磁带可以很容易地替代，使该方法很容易适用于其他蛋白质靶标。
To perform structure/function analyses of a protein in vivo, ideally one should be able to simultaneously abolish expression of the endogenous wild-type protein, substitute it with a form of the protein containing a targeted mutation, and analyze the functional consequences. Until recently, this was a highly challenging and/or laborious approach in mammalian systems, requiring a targeted gene knockin in a human cell line or mouse. Herein is described a RNA interference (RNAi)-based approach to achieve this much more simply in mammalian cells. A single retrovirus has been constructed, which directs expression of a short hairpin RNA (shRNA) to knockdown expression of the endogenous protein of interest; a cDNA coding for a wild-type or mutant version of the same protein that also contains “silent mutations” that do not affect the protein sequence, but do make the mRNA resistant to the shRNA; and a puromycin-resistance gene to allow rapid drug selection of the virus-infected cells. Using this virus, expression of the endogenous Anti-Silencing Function 1a (ASF1a) histone chaperone has been efficiently replaced in primary human cells, by an ectopically expressed epitope-tagged version. Moreover, the virus is designed so that other shRNA and shRNA-resistant cDNA cassettes can easily be substituted, making the approach readily applicable to other protein targets.
登录
查看更多内容
环氧化物——对人类健康有影响吗？
DOI：
--
发表时间：
1980
期刊：
British Journal of Industrial Medicine
影响因子：
--
作者：
M. Manson
通讯作者：
M. Manson
芳香族缩水甘油醚对沙门氏菌的致突变性。
DOI：
10.1016/0165-1218(88)90147-4
发表时间：
1988
期刊：
Mutation research
影响因子：
--
作者：
Rosman,LB;Chakraborty,PK;Messerly,EA;Sinsheimer,JE
通讯作者：
Sinsheimer,JE
缩水甘油醚的遗传毒性和致癌性。
DOI：
10.1016/0278-6915(84)90215-1
发表时间：
1984
期刊：
Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association
影响因子：
--
作者：
J. Hopkins
通讯作者：
J. Hopkins
环氧化物致突变性与 4-(对硝基苯甲基)-吡啶烷基化的相关性
影响因子：
3.5
作者：
K. Hemminki;K. Falck
通讯作者：
K. Falck
吸入环氧乙烷的大鼠外周血淋巴细胞中姐妹染色单体交换的诱导。
DOI：
10.1016/0165-7992(83)90071-4
发表时间：
1983
期刊：
Mutation research
影响因子：
--
作者：
A. Kligerman;G. Erexson;M. Phelps;J. Wilmer
通讯作者：
J. Wilmer