Tightly regulated and homogeneous transgene expression in human adipose-derived mesenchymal stem cells by lentivirus with tet-off system.
Tightly regulated and homogeneous transgene expression in human adipose-derived mesenchymal stem cells by lentivirus with tet-off system.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0066274
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发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Hayakawa T
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Moriyama H;Moriyama M;Sawaragi K;Okura H;Ichinose A;Matsuyama A;Hayakawa T
人类脂肪组织来源的多谱系祖细胞 (hADMPC) 的基因修饰对于其在治疗应用中的开发非常有价值。在这里，我们开发了一种新型的单tet-off慢病毒载体平台。该载体结合了 (1) 修饰的四环素 (tet) 反应元件复合启动子，(2) 多顺反子策略，用于表达改进版本的 tet 控制的反式激活子和普遍存在的启动子控制下的杀稻瘟菌素抗性基因，以及 (3) 受体位点，以便轻松重组克隆感兴趣的基因。在本研究中，我们使用巨细胞病毒（CMV）或延伸因子1α（EF-1α）启动子作为普遍存在的启动子，并引入EGFP作为目的基因。用携带 CMV 启动子或 EF-1α 启动子的慢病毒载体转导的 hADMPC 可以被杀稻瘟菌素有效选择，而不影响其干细胞特性，并且这些细胞中的 EGFP 表达受到多西环素 (Dox) 处理的严格调节。然而，携带 EF-1α 启动子的单个 tet-off 慢病毒载体在 hADMPC 中提供了更均匀的 EGFP 表达。有趣的是，这些 Dox 反应细胞系的分化细胞仅在不存在 Dox 的情况下才组成型表达 EGFP。因此，这种单一的tet-off慢病毒载体为hADMPCs的应用研究提供了重要的工具。
Genetic modification of human adipose tissue–derived multilineage progenitor cells (hADMPCs) is highly valuable for their exploitation in therapeutic applications. Here, we have developed a novel single tet-off lentiviral vector platform. This vector combines (1) a modified tetracycline (tet)-response element composite promoter, (2) a multi-cistronic strategy to express an improved version of the tet-controlled transactivator and the blasticidin resistance gene under the control of a ubiquitous promoter, and (3) acceptor sites for easy recombination cloning of the gene of interest. In the present study, we used the cytomegalovirus (CMV) or the elongation factor 1 α (EF-1α) promoter as the ubiquitous promoter, and EGFP was introduced as the gene of interest. hADMPCs transduced with a lentiviral vector carrying either the CMV promoter or the EF-1α promoter were effectively selected by blasticidin without affecting their stem cell properties, and EGFP expression was strictly regulated by doxycycline (Dox) treatment in these cells. However, the single tet-off lentiviral vector carrying the EF-1α promoter provided more homogenous expression of EGFP in hADMPCs. Intriguingly, differentiated cells from these Dox-responsive cell lines constitutively expressed EGFP only in the absence of Dox. This single tet-off lentiviral vector thus provides an important tool for applied research on hADMPCs.
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