Methods optimization for the expression and purification of human calcium calmodulin-dependent protein kinase II alpha.
Methods optimization for the expression and purification of human calcium calmodulin-dependent protein kinase II alpha.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0285651
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发表时间：
2024
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Kinzer-Ursem, Tamara L.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Bolton, Scott C.;Thompson, David H.;Kinzer-Ursem, Tamara L.
钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）是一种复杂的多功能激酶，在中枢神经组织中高度表达，在钙信号通路中起关键调节作用。尽管有超过30年的重组表达和表征研究，CaMKII继续研究其对信号传导协同性的影响及其通过其多聚体枢纽结构域结合多种底物的能力。在这里，我们比较和优化的方案产生全长野生型人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II α（CaMKIIα）。在昆虫和细菌系统中的表达和纯化的并排比较表明，昆虫表达方法提供了所需的自抑制CaMKIIα全酶的上级产率。利用杆状病毒昆虫表达系统的工具，我们的研究结果表明，高产的方法，以产生均匀的，单分散的CaMKII在其自抑制状态，适合生物物理分析。这两种表达系统（杆状病毒昆虫细胞与大肠杆菌表达）的优点和缺点进行了讨论，以及纯化优化，以最大限度地富集全长CaMKII。
Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) is a complex multifunctional kinase that is highly expressed in central nervous tissues and plays a key regulatory role in the calcium signaling pathway. Despite over 30 years of recombinant expression and characterization studies, CaMKII continues to be investigated for its impact on signaling cooperativity and its ability to bind multiple substrates through its multimeric hub domain. Here we compare and optimize protocols for the generation of full-length wild-type human calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha (CaMKIIα). Side-by-side comparison of expression and purification in both insect and bacterial systems shows that the insect expression method provides superior yields of the desired autoinhibited CaMKIIα holoenzymes. Utilizing baculovirus insect expression system tools, our results demonstrate a high yield method to produce homogenous, monodisperse CaMKII in its autoinhibited state suitable for biophysical analysis. Advantages and disadvantages of these two expression systems (baculovirus insect cell versus Escherichia coli expression) are discussed, as well as purification optimizations to maximize the enrichment of full-length CaMKII.
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影响因子：
7.7
作者：
Karandur D;Bhattacharyya M;Xia Z;Lee YK;Muratcioglu S;McAffee D;McSpadden ED;Qiu B;Groves JT;Williams ER;Kuriyan J
通讯作者：
Kuriyan J
影响因子：
5.3
作者：
Dosemeci, A;Reese, TS;Cheng, JHT
通讯作者：
Cheng, JHT
影响因子：
64.5
作者：
Chao LH;Stratton MM;Lee IH;Rosenberg OS;Levitz J;Mandell DJ;Kortemme T;Groves JT;Schulman H;Kuriyan J
通讯作者：
Kuriyan J
影响因子：
4.7
作者：
Hudmon, A;Kim, SA;Waxham, MN
通讯作者：
Waxham, MN
影响因子：
3.5
作者：
Vest, Rebekah S.;O'Leary, Heather;Bayer, K. Ulrich
通讯作者：
Bayer, K. Ulrich