Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors.
Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors.
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DOI：
10.1038/nprot.2017.153
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发表时间：
2018-01
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
Ohtsuka M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Miura H;Quadros RM;Gurumurthy CB;Ohtsuka M
基于CRISPR/Cas9的基因组编辑可以通过破坏基因序列轻松生成敲除小鼠模型，但其创建需要插入外源DNA（敲入）或替换基因组片段的模型的效率非常差。研究中使用的大多数小鼠模型是敲入（报告基因或重组酶）或基因置换（例如，含有LoxP位点侧翼外显子的条件性敲除等位基因）。已经报道了使用双链DNA作为供体来创建这种模型的一些方法，但是它们的效率通常为1-10%，因此不适合常规使用。我们最近证明，长的单链DNA作为非常有效的供体，插入和基因置换。我们将这种方法称为Easy-CRISPR（ssDNA插入物的高效添加-CRISPR），这是一种高效技术（通常为30%-60%，在某些情况下高达100%）。该方案需要大约两个月的时间来产生创始人小鼠。
CRISPR/Cas9-based genome editing can easily generate knockout mouse models by disrupting the gene sequence, but its efficiency for creating models that require either insertion of exogenous DNA (knock-in) or replacement of genomic segments is very poor. The majority of mouse models used in research are knock-in (reporters or recombinases) or gene-replacement (for example, conditional knockout alleles containing LoxP sites flanked exons). A few methods for creating such models have been reported using double-stranded DNA as donors, but their efficiency is typically 1–10% and therefore not suitable for routine use. We recently demonstrated that long single-stranded DNAs serve as very efficient donors, both for insertion and for gene replacement. We call this method Easi-CRISPR (Efficient additions with ssDNA inserts-CRISPR), a highly efficient technology (typically 30%−60%, and up to 100% in some cases). The protocol takes approximately two months to generate the founder mice.
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