Site-specific labeling of supercoiled DNA.
Site-specific labeling of supercoiled DNA.
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DOI：
10.1093/nar/gkl642
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发表时间：
2006
影响因子：
14.9
通讯作者：
Lyubchenko YL
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lushnikov AY;Potaman VN;Lyubchenko YL
长线状或环形DNA中特定位点标记的可视化可以明确地识别各种局部DNA结构。在这里，我们描述了一种新颖而有效的位点特异性DNA标记方法。限制性内切酶SfiI与DNA结合，但在有钙存在的情况下保持不变，因此可以作为13个核苷酸识别位点的蛋白质标记。由于SfiI需要同时与两个DNA识别位点相互作用才能稳定结合，因此可以通过在DNA靶标中提供一个分离的识别位点和另外一个也包含识别位点的短DNA双链来满足这一要求。用原子力显微镜观察了SfiI/DNA复合体，并通过长度测量证实了标记的特异性。使用这种方法，在大量过剩的辅助双链存在的情况下标记质粒DNA中的两个位置，以竞争分子内突触复合体的环状结构的形成。我们表明，标记过程不会干扰超螺旋张力驱动的替代DNA结构的形成，如十字形。该络合物在低pH和高pH(pH 5和9)下相对稳定，使所开发的方法在需要改变pH的条件下具有吸引力。
Visualization of site-specific labels in long linear or circular DNA allows unambiguous identification of various local DNA structures. Here we describe a novel and efficient approach to site-specific DNA labeling. The restriction enzyme SfiI binds to DNA but leaves it intact in the presence of calcium and therefore may serve as a protein label of 13 bp recognition sites. Since SfiI requires simultaneous interaction with two DNA recognition sites for stable binding, this requirement is satisfied by providing an isolated recognition site in the DNA target and an additional short DNA duplex also containing the recognition site. The SfiI/DNA complexes were visualized with AFM and the specificity of the labeling was confirmed by the length measurements. Using this approach, two sites in plasmid DNA were labeled in the presence of a large excess of the helper duplex to compete with the formation of looped structures of the intramolecular synaptic complex. We show that the labeling procedure does not interfere with the superhelical tension-driven formation of alternative DNA structures such as cruciforms. The complex is relatively stable at low and high pH (pH 5 and 9) making the developed approach attractive for use at conditions requiring the pH change.
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