Site-Specific Protein Labeling with N-Hydroxysuccinimide-Esters and the Analysis of Ubiquitin Ligase Mechanisms.
Site-Specific Protein Labeling with N-Hydroxysuccinimide-Esters and the Analysis of Ubiquitin Ligase Mechanisms.
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DOI：
10.1021/jacs.8b05098
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发表时间：
2018-08-01
影响因子：
15
通讯作者：
Cole PA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Dempsey DR;Jiang H;Kalin JH;Chen Z;Cole PA
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）-酯广泛用于在游离氨基上非选择性地标记蛋白质。这种广泛的标记可能是不利的，因为它可能干扰蛋白质结构或功能，并且因为化学计量控制不好。在这里，我们描述了一个简单的方法来转换NHS-酯的N-末端半胱氨酸残基上的位点特异性的蛋白质标记。MESNA加成将NHS-酯转化为用于N-Cys修饰的化学选择性硫酯。该标记策略被应用于阐明泛素E3连接酶WWP 2的机制特征，包括其与其底物之一，肿瘤抑制因子PTEN的相互作用，以及其autoubiquitination分子性。我们建议，这种方便的蛋白质标记策略将允许NHS-酯在生化研究中的扩展应用。
N-hydroxysuccinimide (NHS)-esters are widely used to label proteins non-selectively on free amino groups. Such broad labeling can be disadvantageous because it can interfere with protein structure or function and because stoichiometry is poorly controlled. Here we describe a simple method to transform NHS-esters into site-specific protein labeling on N-terminal Cys residues. MESNA addition converts NHS-esters to chemoselective thioesters for N-Cys modification. This labeling strategy was applied to clarify mechanistic features of the ubiquitin E3 ligase WWP2 including its interaction with one of its substrate, the tumor suppressor PTEN, as well as its autoubiquitination molecularity. We propose that this convenient protein labeling strategy will allow for an expanded application of NHS-esters in biochemical investigation.
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