Reducing the inherent auto-inhibitory interaction within the pegRNA enhances prime editing efficiency.
Reducing the inherent auto-inhibitory interaction within the pegRNA enhances prime editing efficiency.
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DOI：
10.1093/nar/gkad456
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发表时间：
2023-07-21
影响因子：
14.9
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
引物编辑系统已经使得能够在基因组内掺入精确的编辑而不引入双链断裂。先前的研究根据序列组成定义了1013个核苷酸的pegRNA的最佳引物结合位点（PBS）长度。然而，最佳PBS长度表征是基于使用质粒或慢病毒表达系统的引物编辑结果。在这项研究中，我们证明，对于prime editor（PE）核糖核蛋白复合物，PBS和间隔序列之间的自抑制相互作用会影响pegRNA的结合效率和靶点识别。通过降低PBS-间隔区之间的互补性来使这种自抑制相互作用失稳，增强了多种引物编辑形式中的引物编辑效率。在末端受保护的pegRNA的情况下，具有接近37°C的PBS-靶链解链温度的较短PBS长度在哺乳动物细胞中是最佳的。此外，PE-pegRNA递送后细胞的短暂冷休克处理进一步增加了具有优化PBS长度的pegRNA的主要编辑结果。最后，我们表明，使用这些优化参数设计的pegRNA编程的主要编辑器核糖核蛋白复合物有效地纠正了患者来源的成纤维细胞中与疾病相关的基因突变，并有效地在原代人类T细胞和斑马鱼中进行精确编辑。
Prime editing systems have enabled the incorporation of precise edits within a genome without introducing double strand breaks. Previous studies defined an optimal primer binding site (PBS) length for the pegRNA of ∼13 nucleotides depending on the sequence composition. However, optimal PBS length characterization has been based on prime editing outcomes using plasmid or lentiviral expression systems. In this study, we demonstrate that for prime editor (PE) ribonucleoprotein complexes, the auto-inhibitory interaction between the PBS and the spacer sequence affects pegRNA binding efficiency and target recognition. Destabilizing this auto-inhibitory interaction by reducing the complementarity between the PBS-spacer region enhances prime editing efficiency in multiple prime editing formats. In the case of end-protected pegRNAs, a shorter PBS length with a PBS-target strand melting temperature near 37°C is optimal in mammalian cells. Additionally, a transient cold shock treatment of the cells post PE-pegRNA delivery further increases prime editing outcomes for pegRNAs with optimized PBS lengths. Finally, we show that prime editor ribonucleoprotein complexes programmed with pegRNAs designed using these refined parameters efficiently correct disease-related genetic mutations in patient-derived fibroblasts and efficiently install precise edits in primary human T cells and zebrafish.
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影响因子：
12.3
作者：
Park SJ;Jeong TY;Shin SK;Yoon DE;Lim SY;Kim SP;Choi J;Lee H;Hong JI;Ahn J;Seong JK;Kim K
通讯作者：
Kim K
通过在 pegRNA 中引入同义突变或稳定其结构进行高效的引物编辑
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作者：
Li X;Zhou L;Gao BQ;Li G;Wang X;Wang Y;Wei J;Han W;Wang Z;Li J;Gao R;Zhu J;Xu W;Wu J;Yang B;Sun X;Yang L;Chen J
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作者：
Liang, Shun-Qing;Liu, Pengpeng;Wolfe, Scot A.
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Wolfe, Scot A.
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Adikusuma F;Lushington C;Arudkumar J;Godahewa GI;Chey YCJ;Gierus L;Piltz S;Geiger A;Jain Y;Reti D;Wilson LOW;Bauer DC;Thomas PQ
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Thomas PQ
影响因子：
16.6
作者：
Liu P;Liang SQ;Zheng C;Mintzer E;Zhao YG;Ponnienselvan K;Mir A;Sontheimer EJ;Gao G;Flotte TR;Wolfe SA;Xue W
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Xue W