Quantifying transcription factor binding dynamics at the single-molecule level in live cells.
Quantifying transcription factor binding dynamics at the single-molecule level in live cells.
复制标题
量化活细胞中单分子水平的转录因子结合动力学。
DOI：
10.1016/j.ymeth.2017.03.014
复制
发表时间：
2017-07-01
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Hager GL
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Presman DM;Ball DA;Paakinaho V;Grimm JB;Lavis LD;Karpova TS;Hager GL
在定量荧光显微镜领域的进步，技术成就允许来自许多不同领域的研究开始解开活细胞内生物过程的动态错综复杂。从超分辨率显微镜技术到跟踪单个蛋白质，荧光显微镜正在改变我们对细胞工作方式的看法。幸运的是，越来越多的研究小组正在探索活细胞中的单分子研究。然而，在该技术的几个关键方面，如图像采集条件或所获得数据的分析，还没有明确的共识。在这里，我们描述了一个详细的方法来执行活细胞中的转录因子的单分子跟踪（SMT），以获得关键的结合特性，即它们的停留时间和结合分数。我们讨论了不同类型的荧光团，标记密度，显微镜，相机，数据采集和数据分析。使用糖皮质激素受体作为模型转录因子，我们比较了替代标签（GFP，mEOS，HaloTag，SNAP-标签，CLIP-标签）的潜在的可移植应用。我们还研究了不同的方法来提取解离速率，并将它们与模拟数据进行比较。最后，我们讨论了这一令人兴奋的技术仍然面临的几个挑战。
Progressive, technological achievements in the quantitative fluorescence microscopy field are allowing researches from many different areas to start unraveling the dynamic intricacies of biological processes inside living cells. From super-resolution microscopy techniques to tracking of individual proteins, fluorescence microscopy is changing our perspective on how the cell works. Fortunately, a growing number of research groups are exploring single-molecule studies in living cells. However, no clear consensus exists on several key aspects of the technique such as image acquisition conditions, or analysis of the obtained data. Here, we describe a detailed approach to perform single-molecule tracking (SMT) of transcription factors in living cells to obtain key binding characteristics, namely their residence time and bound fractions. We discuss different types of fluorophores, labeling density, microscope, cameras, data acquisition, and data analysis. Using the glucocorticoid receptor as a model transcription factor, we compared alternate tags (GFP, mEOS, HaloTag, SNAP-tag, CLIP-tag) for potential multicolor applications. We also examine different methods to extract the dissociation rates and compare them with simulated data. Finally, we discuss several challenges that this exciting technique still faces.
登录
查看更多内容
影响因子：
56.9
作者：
Elf, Johan;Li, Gene-Wei;Xie, X. Sunney
通讯作者：
Xie, X. Sunney
影响因子：
56.9
作者：
Knight, Spencer C.;Xie, Liangqi;Tjian, Robert
通讯作者：
Tjian, Robert
影响因子：
48
作者：
Grimm, Jonathan B.;English, Brian P.;Lavis, Luke D.
通讯作者：
Lavis, Luke D.
DOI：
10.1007/978-1-4939-3631-1_17
发表时间：
2016-01-01
期刊：
Chromosome Architecture: Methods and Protocols
影响因子：
--
作者：
Basu, Srinjan;Tan, Yi Lei;Lee, Steven F.
通讯作者：
Lee, Steven F.
DOI：
10.1007/978-1-61779-477-3_12
发表时间：
2012
期刊：
Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)
影响因子：
--
作者：
Mazza D;Stasevich TJ;Karpova TS;McNally JG
通讯作者：
McNally JG