gDesigner: computational design of synthetic gRNAs for Cas12a-based transcriptional repression in mammalian cells.
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DOI：
10.1038/s41540-022-00241-w
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发表时间：
2022-09-16
影响因子：
4
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中科院分区：
文献类型：
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作者：
合成网络需要复杂的相互交织的基因调控，通常依赖于目标基因的转录激活或抑制。基于CRISPRi的转录因子有助于对内源性或合成启动子活性的可编程调节，这一过程可以通过使用软件选择适当的gRNA并限制非特异性基因调节来优化。在这里，我们开发了一个计算软件流水线，gDesigner，它能够自动选择具有最小偏离靶标效应和启动子串扰的正交gRNA。接下来，我们设计了一个基于乳酸菌Cas12a(DLbCas12a)的抑制系统，该系统通过同源启动子的空间位阻来下调靶基因的表达。最后，我们构建了一个正交化合成的dCas12a抑制启动子文库，并在HEK293FT、U2OS和H1299细胞系中进行了实验验证。我们的系统扩展了哺乳动物合成启动子工具包，使用了一个基于CRISPRi的新的互补和正交的系统，最终能够设计用于多重基因扰动的合成启动子文库，从而促进对复杂细胞表型的理解。
Synthetic networks require complex intertwined genetic regulation often relying on transcriptional activation or repression of target genes. CRISPRi-based transcription factors facilitate the programmable modulation of endogenous or synthetic promoter activity and the process can be optimised by using software to select appropriate gRNAs and limit non-specific gene modulation. Here, we develop a computational software pipeline, gDesigner, that enables the automated selection of orthogonal gRNAs with minimized off-target effects and promoter crosstalk. We next engineered a Lachnospiraceae bacterium Cas12a (dLbCas12a)-based repression system that downregulates target gene expression by means of steric hindrance of the cognate promoter. Finally, we generated a library of orthogonal synthetic dCas12a-repressed promoters and experimentally demonstrated it in HEK293FT, U2OS and H1299 cells lines. Our system expands the toolkit of mammalian synthetic promoters with a new complementary and orthogonal CRISPRi-based system, ultimately enabling the design of synthetic promoter libraries for multiplex gene perturbation that facilitate the understanding of complex cellular phenotypes.
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作者：
Li Y;Jiang Y;Chen H;Liao W;Li Z;Weiss R;Xie Z
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Xie Z
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Andronescu, M;Zhang, ZC;Condon, A
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Engler, Carola;Kandzia, Romy;Marillonnet, Sylvestre
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BRON, C;KERBOSCH, J
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