Selection and validation of reference genes for RT-qPCR-based analyses of Anastatus japonicus Ashmead (Hymenoptera: Helicopteridae).
Selection and validation of reference genes for RT-qPCR-based analyses of Anastatus japonicus Ashmead (Hymenoptera: Helicopteridae).
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基于逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析的日本平腹小蜂（膜翅目：旋小蜂科）内参基因的筛选与验证
DOI：
10.3389/fphys.2022.1046204
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发表时间：
2022
影响因子：
4
通讯作者：
Li, Dunsong
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Liu, Zixin;Xiao, Junjiang;Xia, Yue;Wu, Qifeng;Zhao, Can;Li, Dunsong
RT-qPCR仍然是分子生物学研究的重要方法，旨在量化一系列生理或病理环境中的基因表达。然而，使用适当的参考基因对于获得有意义的RT-qPCR结果至关重要。平腹小蜂是一种重要的卵寄生蜂，也是果实蝽类和森林毛虫的天敌。最近的转录组学研究分析了A.标本，提供了一个强大的基础功能研究集中在这寄生蜂，没有验证A。目前还没有确定可供参考的基因，这阻碍了进一步的研究工作。因此，本研究试图通过筛选最稳定的内参基因来解决这个问题。对样品进行测序，以进行可靠的RT-qPCR分析。通过比较发育阶段（幼虫、蛹、成虫）、组织（腹部、胸部、头部）、性别（雄性或雌性成虫）或滞育状态（滞育诱导25、35、45或55天或滞育终止），在4种不同条件下评估8个候选参考基因（ACTIN、TATA、GAPDH、TUB、RPL 13、RPS 6、EF 1 α、RPS 3a）的效用。基于四种算法（BestKeeper、Normfinder、geNorm和ΔCt方法）的整合，使用参考基因计算基因稳定性，以确定最佳RT-qPCR参考基因。在此基础上，RPS 6和RPL 13是评价不同发育阶段的最佳参考基因，ACTIN和EF 1 α是评价不同性别成虫的最佳参考基因，RPL 13和EF 1 α是评价不同组织的最佳参考基因，TATA和ACTIN是评价不同滞育状态的最佳参考基因。这些结果为进一步的A.在一系列实验条件下，研究了EMP 3基因的表达和功能。
RT-qPCR remains a vital approach for molecular biology studies aimed at quantifying gene expression in a range of physiological or pathological settings. However, the use of appropriate reference genes is essential to attain meaningful RT-qPCR results. Anastatus japonicus Ashmead (Hymenoptera: Helicopteridae) is an important egg parasitoid wasp and natural enemy of fruit bugs and forest caterpillars. While recent transcriptomic studies have analyzed gene expression profiles in A. japonicus specimens, offering a robust foundation for functional research focused on this parasitoid, no validated A. japonicus reference genes have yet been established, hampering further research efforts. Accordingly, this study sought to address this issue by screening for the most stable internal reference genes in A. japonicus samples to permit reliable RT-qPCR analyses. The utility of eight candidate reference genes (ACTIN, TATA, GAPDH, TUB, RPL13, RPS6, EF1α, RPS3a) was assessed under four different conditions by comparing developmental stages (larvae, pupae, adults), tissues (abdomen, chest, head), sex (male or female adults), or diapause states (diapause induction for 25, 35, 45, or 55 days, or diapause termination). RefFinder was used to calculate gene stability based on the integration of four algorithms (BestKeeper, Normfinder, geNorm, and ΔCt method) to determine the optimal RT-qPCR reference gene. Based on this approach, RPS6 and RPL13 were found to be the most reliable reference genes when assessing different stages of development, while ACTIN and EF1α were optimal when comparing adults of different sexes, RPL13 and EF1α were optimal when analyzing different tissues, and TATA and ACTIN were optimal for different diapause states. These results provide a valuable foundation for future RT-qPCR analyses of A. japonicus gene expression and function under a range of experimental conditions.
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