Elucidation of ubiquitin-conjugating enzymes that interact with RBR-type ubiquitin ligases using a liquid-liquid phase separation-based method.
Elucidation of ubiquitin-conjugating enzymes that interact with RBR-type ubiquitin ligases using a liquid-liquid phase separation-based method.
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DOI：
10.1016/j.jbc.2022.102822
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发表时间：
2023-02
影响因子：
4.8
通讯作者：
Yamano, Koji
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Hayashida, Ryota;Kikuchi, Reika;Imai, Kenichiro;Kojima, Waka;Yamada, Tatsuya;Iijima, Miho;Sesaki, Hiromi;Tanaka, Keiji;Matsuda, Noriyuki;Yamano, Koji
RING (RBR) 型泛素 (Ub) 连接酶 (E3)（例如 Parkin）响应连接酶激活，从 Ub 结合酶 (E2) 接收 Ub。然而，由于没有足够的方法来监测它们的相互作用，将 Ub 转移到每个 RBR 型连接酶的特定 E2 在很大程度上是未知的。为了解决这个问题，我们开发了一种检测 E2 和激活的 Parkin 之间细胞内相互作用的方法。仅当 E2 与 Parkin 相互作用时，与 E2 融合的荧光同源四聚体 Azami-Green 以及与 Parkin 融合的寡聚 Ash（组装辅助蛋白）才能在细胞中形成液-液相分离 (LLPS)。使用这种方法，我们鉴定了线粒体自噬期间受损线粒体上与激活的 Parkin 相互作用的多个 E2。结合体外泛素化检测和生物信息学，这些发现揭示了 E2 与激活的 Parkin 相互作用的潜在共识序列。将此方法应用于其他 RBR 型 E3（包括 HOIP、HHARI 和 TRIAD1）表明，HOIP 与其底物 NEMO 响应促炎细胞因子形成 LLPS，并且 HHARI 和 TRIAD1 形成独立于 Ub 样蛋白 NEDD8 的胞质 LLPS。由于 E2-E3 相互作用是 RBR 型 E3 激活和随后的底物泛素化的先决条件，因此我们在此建立的方法可以作为细胞内工具来阐明 RBR 型 E3 涉及的潜在新颖机制。
RING-between RING (RBR)-type ubiquitin (Ub) ligases (E3s) such as Parkin receive Ub from Ub-conjugating enzymes (E2s) in response to ligase activation. However, the specific E2s that transfer Ub to each RBR-type ligase are largely unknown because of insufficient methods for monitoring their interaction. To address this problem, we have developed a method that detects intracellular interactions between E2s and activated Parkin. Fluorescent homotetramer Azami-Green fused with E2 and oligomeric Ash (Assembly helper) fused with Parkin form a liquid–liquid phase separation (LLPS) in cells only when E2 and Parkin interact. Using this method, we identified multiple E2s interacting with activated Parkin on damaged mitochondria during mitophagy. Combined with in vitro ubiquitination assays and bioinformatics, these findings revealed an underlying consensus sequence for E2 interactions with activated Parkin. Application of this method to other RBR-type E3s including HOIP, HHARI, and TRIAD1 revealed that HOIP forms an LLPS with its substrate NEMO in response to a proinflammatory cytokine and that HHARI and TRIAD1 form a cytosolic LLPS independent of Ub-like protein NEDD8. Since an E2–E3 interaction is a prerequisite for RBR-type E3 activation and subsequent substrate ubiquitination, the method we have established here can be an in-cell tool to elucidate the potentially novel mechanisms involved in RBR-type E3s.
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Kelsall, Ian R.;Duda, David M.;Olszewski, Jennifer L.;Hofmann, Kay;Knebel, Axel;Langevin, Frederic;Wood, Nicola;Wightman, Melanie;Schulman, Brenda A.;Alpi, Arno F.
通讯作者：
Alpi, Arno F.
DOI：
10.1083/jcb.201210111
发表时间：
2013-01-21
期刊：
The Journal of cell biology
影响因子：
--
作者：
Lazarou M;Narendra DP;Jin SM;Tekle E;Banerjee S;Youle RJ
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作者：
Ariffin, Juliana K.;Kapetanovic, Ronan;Sweet, Matthew J.
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Sweet, Matthew J.