Einzelmoleküluntersuchungen von DNA-Helikasenmotoren an DNA und Chromatin

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DNA-Motorproteinkomplexe sind die treibenden Elemente in existenziellen Prozessen des Zellzyklus. Diese zellulären Maschinen werden häufig von DNA-Helikasen angetrieben. DNAHelikasen sind multifunktionelle Enzyme, deren grundlegende Funktion darin besteht DNADuplexe zu entwinden und in ihre Einzelstränge zu zerlegen. Dieser Prozess ist an die Hydrolyse von Nukleosidtriphosphaten gekoppelt. Das Ziel des Projektes ist die Mechanismen von Helikasen zu verstehen. Obwohl Helikasen ein ähnliches Strukturmotiv nutzen, um Nukleosidtriphosphate zu hydrolysieren, können ihre Funktionen völlig verschiedenartig sein. Deshalb werden sich die Untersuchungen darauf fokussieren, wie gemeineinsame Helikasemechanismen adaptiert sind und zu komplexen Funktionsweisen führen, entsprechend ihrer Spezialisierung in DNA-Replikation, Rekombination, Reparatur und Transkription. Um ein möglichst detailreiches Abbild der Motorfunktion zu bekommen, ist sehr hilfreich Einzelmoleküle in Echtzeit zu beobachten. Dies gibt Aufschluss über die dynamischen Eigenschaften von einzelnen Enzymen, die häufig in konventionellen Ensemblemessungen, bei denen über eine große Population von Molekülen gemittelt wird, verloren gehen. Zur Untersuchung der DNA-Motoren sollen ¿State-of-the-aif -Einzelmolekültecnniken, wie Magnetische Pinzette, AFM, und Einzelmolekülfluoreszenz angewendet und für das konkrete Anwendungsgebiet weiter entwickelt werden. Diese Techniken sollen grundlegendes Wissen zu Translokationsraten, generierten Kräften, Prozessivität, Initiierung und Beendigung der Helikaseaktivität, Koordination zwischen verschiedenen Motoren, Drehmomentgenerierung, Schrittgrößen und Bewegungsmechanismus entlang des DNA-Templates für verschiedene Helikasensysteme (SF2 Helikasen, replikative Helikasen) liefern. Die Adaption dieser Parameter an die spezifische Funktionalität des Enzyms soll Aufschluss über den eigentlichen Mechanismus des Motorenzyms geben. Die Untersuchungen der Helikasenmotoren sollen zuerst an nativer DNA durchgeführt werden. Später sollen diese Experimente an Chromatin durchgeführt werden. Ziel ist es, Methoden zu entwickeln, mit denen die Umstrukturierung von Chromatin durch DNA-Motoren beobachtet werden kann. Damit soll ein Werkzeug geschaffen werden, mit dem eine Vielzahl von existenziellen Prozessen, wie DNA-Transkription, Reparatur, Replikation und Nukleosommodifikation, im Zusammenwirken mit Chromatin an Einzelmolekülen untersucht werden kann.