A Single-Molecule View of Initial Transcription

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Das übergeordnete Ziel des vorliegenden Antrages ist eine Untersuchung der initialen Phase der Gentranskription, also der Transformation genetischer Information von DNA zu RNA, auf der Ebene von einzelnen Molekülen. Transiente Intermediate und konformelle Änderungen des Proteins RNA Polymerase, welches die Gentranskription ausführt, sollen mit Hilfe von modernsten Techniken der Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie in Kombination mit nanometer-genauen Methoden zur Abstandsmessung (basierend auf Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer, FRET) untersucht werden. Mit diesen Techniken ist man in der Lage, die initialen Schritte der Gentranskription in Echtzeit zu beobachten (z.B. konformelle Änderungen in RNA Polymerase während der Addition einer einzelnen Nukleobase an die RNA Kette), um so die statischen Bilder des Transkriptionsprozesses aus der Röntgenbeugung zu ergänzen und zu verfeinern. Die konkreten Ziele des vorliegenden Antrages sind die Entwicklung von FRET basierten Untersuchungsmethoden (“FRET-assays“) für die Echtzeit-Beobachtung von Transkription in vitro. Es soll dabei die Öffnung der abgelesenen DNA und das Verlassen des sogenannten “promoters“ beobachtet werden. Weiterhin sollen die Einflüsse verschiedener DNA-Sequenzen auf ratenbestimmende Schritte der Transkription (“promoter-proximal pausing“) untersucht werden. Schlussendlich sollen die Untersuchungsmethoden oder “FRET-assays“ auch in lebenden bakteriellen Zellen angewandt werden. Die geplanten Arbeiten werden somit zu einem grundlegenden Verständnis der initialen Transkription beitragen, das in Zukunft auch auf höhere Organismen – wie den Menschen – übertragen werden könnte. Die zu entwickelnden Untersuchungsmethoden könnten zukünftig aber auch für das Studium anderer wichtiger Protein-DNA Wechselwirkungen in vitro und in vivo Verwendung finden.