Präparation semi-synthetischer Proteine durch ein neuartiges trans-spleißendes Intein

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Inteine knüpfen Peptidbindungen zwischen zwei beliebigen Polypeptiden, die als N- und C-Exteine mit der Inteindomäne fusioniert sind. Wir haben ein neuartiges gespaltenes Intein entwickelt, dessen N-terminaler Teil aus lediglich 11 Aminosäuren besteht und mittels Peptidfestphasensynthese präpariert werden kann. Durch Protein-trans-Spleißen kann so ein synthetisches Peptid chemo- und regioselektiv an den N-Terminus eines rekombinanten Protein verknüpft werden. Damit entfällt gegenüber herkömmlichen Methoden die Notwendigkeit zur Synthese eines C-terminalen Thioesters, Auf diese Weise werden funktionale chemisch-biologische Hybridverbindungen synthetisiert. In diesem Projekt sollen die Reaktionsbedingungen für das gespaltene Intein weiter optimiert, die Verträglichkeit verschiedener chemischer Funktionalitäten im synthetischen Peptid getestet und die Affinität zwischen den beiden Inteinteilen durch ein Fluorescence-resonance-energy-transfer (FRET)-Assay bestimmt werden. Ebenfalls mit FRET-Techniken sollen verschiedene Konformationszustände von nichtribosomalen Peptidsynthetasenfragmenten untersucht werden, um strukturelle und dynamische Einblicke in die Mechanismen dieser multimodularen Synthesemaschinen zu gewinnen. Die geeigneten Fluorophorsonden werden durch die neue Technik des Protein-trans-Spleißens und andere Methoden in die Proteine eingebaut.