Nonribosomal peptide synthetases (NRPSs): Understanding functional domain interplay and biosynthetic directionality using FRET spectroscopy

非核糖体肽合成酶 (NRPS):使用 FRET 光谱了解功能域相互作用和生物合成方向性

基本信息

项目摘要

Non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs) are mega-enzymes that act as protein templates and catalysts for the biosynthesis of many important peptide natural products like daptomycin and cyclosporine. The single amino acid building blocks are activated by adenylation domains (A domains) under the consumption of ATP, covalently bound as thioesters on 4’-phosphopantetheine-equipped peptidyl-carrier proteins (PCP domains) and linked by condensation domains (C domains). Further domains like the epimerization domain (E domain) provide additional structural diversification. A thioesterase domain (TE domain) releases the final product. In a typical linear NRPS simple rules dictate the necessary domain arrangements for a certain peptide product. To incorporate a single amino acid, all necessary domains are integrated into one module and the order of modules in the multifunctional enzyme corresponds to the sequence of the amino acids in the product. However, only very little is known about the temporal and spatial nature of intramolecular domain-domain interactions and how these translate into the essential directionality of the step-wise peptide assembly. Crystal structures of multi-domain NRPS fragments provide important insight, but only represent static snap-shots that lack dynamic information. Very recently, we have reported the first FRET sensor of a simplified A-PCP di-domain to investigate conformational changes of the catalytically active enzyme in real time using time-course experiments. These studies have already led to important new insights and models. Here, we propose to significantly expand the concept to study the dynamics of NRPSs using FRET. We expect to gain novel mechanistic insights into how directional NRPS biosynthesis is driven.
非核糖体肽合成酶(NRPS)是作为蛋白质模板和催化剂用于许多重要肽天然产物如达托霉素和环孢霉素的生物合成的巨型酶。单个氨基酸结构单元在ATP消耗下被腺苷酸化结构域(A结构域)激活,作为硫酯共价结合在配备有4 '-磷酸泛酰巯基乙胺的肽基载体蛋白(PCP结构域)上,并通过缩合结构域(C结构域)连接。其他结构域如差向异构化结构域(E结构域)提供额外的结构多样化。硫酯酶结构域(TE结构域)释放最终产物。在典型的线性NRPS中,简单的规则决定了某些肽产物的必要结构域排列。为了掺入单个氨基酸,所有必需的结构域被整合到一个模块中,并且多功能酶中模块的顺序对应于产物中氨基酸的序列。然而,只有很少的是知道的时间和空间性质的分子内结构域的相互作用,以及如何将这些转化为必要的方向性的逐步肽组装。多结构域NRPS片段的晶体结构提供了重要的见解,但仅代表静态快照,缺乏动态信息。最近,我们报道了第一个FRET传感器的简化A-PCP双域调查构象变化的催化活性酶在真实的时间使用时程实验。这些研究已经产生了重要的新见解和模型。在这里,我们建议显着扩大的概念,研究动态的NRPS使用FRET。我们期望获得新的机制的见解如何定向NRPS生物合成驱动。

项目成果

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