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細胞内人工核酸複製系の開発

细胞内人工核酸复制系统的研制

基本信息

批准号：
21J01382
负责人：
橋本講司
金额：
$ 2.33万
依托单位：
The University of Tokyo (2022)Nagoya University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J01382/
关键词：
合成生物学オーソゴナル複製

项目摘要

申請者は、大腸菌の複製系と独立して稼働するオーソゴナル複製系を大腸菌内に構築することで、大腸菌のシステムを借りて任意の人工核酸を複製することを目的として研究を行った。まず、ファージ複製システムのin vitro再構成系を利用して、オーソゴナル複製の場となる直鎖状プラスミドを大量合成した。次に、ファージ複製系に必要な４つの遺伝子を、１つの大腸菌発現用プラスミドに全てクローニングし大腸菌に形質転換することで、直鎖状プラスミドを複製可能な合成大腸菌を構築した。さらに、この合成大腸菌に対して直鎖状プラスミドを導入することにも成功した。今後は、直鎖状プラスミドが大腸菌内に維持されることを確認し、最終的に人工核酸を複製させることを見据えて、直鎖状プラスミドが効率的に維持される条件を確定していく。また受入研究室である名古屋大学阿部研究室の強みを活かして、大腸菌内で複製された修飾核酸を定量する方法の開発も行った。修飾核酸をフォスファターゼおよびヌクレアーゼ処理することでヌクレオシド化したのち、逆相クロマトグラフィーで解析することで、人工核酸中に含まれる修飾ヌクレオシドを定量することに成功した。この手法は細胞内で複製に使われた人工核酸を精密に定量するための強力な分析化学手法になると期待している。申請者は、特別研究員奨励費受給資格喪失を理由に翌年度は交付申請を辞退するが、過去2年間の研究によって、オーソゴナル複製系を稼働し、さらにそれを安定的に保持するための合成大腸菌を作製することができた。今後はこれら２つを組み合わせ、実際に合成大腸菌内でオーソゴナル複製系を稼働させ、あらゆる人工核酸を複製可能な合成大腸菌の創製を目指す。

The applicant is conducting research on how to construct a complete replication system and an independent replication system of Escherichia coli within Escherichia coli, and how the Escherichia coli system can replicate with arbitrary artificial nucleic acids. The in vitro reconstruction of the replication system is based on a large number of synthesis methods. Second, replication is necessary for the construction of synthetic E. coli. This is a successful introduction of synthetic E. coli. In the future, the conditions for maintaining the efficiency of DNA replication in E. coli will be determined. Development of a method for the quantification of cloned modified nucleic acids in Escherichia coli The modified nucleic acid was successfully quantified by reverse phase analysis. This technique is expected to replicate artificial nucleic acids precisely in cells and to quantify them with powerful analytical chemistry. The applicant shall be disqualified from receiving the incentive fee for the next year. The applicant shall be dismissed from the application for the past two years. The applicant shall be entitled to receive the incentive fee for the next year. In the future, we will focus on the development of synthetic E. coli and the replication of artificial nucleic acids.