細胞内人工核酸複製系の開発

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申請者は、大腸菌の複製系と独立して稼働するオーソゴナル複製系を大腸菌内に構築することで、大腸菌のシステムを借りて任意の人工核酸を複製することを目的として研究を行った。まず、ファージ複製システムのin vitro再構成系を利用して、オーソゴナル複製の場となる直鎖状プラスミドを大量合成した。次に、ファージ複製系に必要な４つの遺伝子を、１つの大腸菌発現用プラスミドに全てクローニングし大腸菌に形質転換することで、直鎖状プラスミドを複製可能な合成大腸菌を構築した。さらに、この合成大腸菌に対して直鎖状プラスミドを導入することにも成功した。今後は、直鎖状プラスミドが大腸菌内に維持されることを確認し、最終的に人工核酸を複製させることを見据えて、直鎖状プラスミドが効率的に維持される条件を確定していく。また受入研究室である名古屋大学阿部研究室の強みを活かして、大腸菌内で複製された修飾核酸を定量する方法の開発も行った。修飾核酸をフォスファターゼおよびヌクレアーゼ処理することでヌクレオシド化したのち、逆相クロマトグラフィーで解析することで、人工核酸中に含まれる修飾ヌクレオシドを定量することに成功した。この手法は細胞内で複製に使われた人工核酸を精密に定量するための強力な分析化学手法になると期待している。申請者は、特別研究員奨励費受給資格喪失を理由に翌年度は交付申請を辞退するが、過去2年間の研究によって、オーソゴナル複製系を稼働し、さらにそれを安定的に保持するための合成大腸菌を作製することができた。今後はこれら２つを組み合わせ、実際に合成大腸菌内でオーソゴナル複製系を稼働させ、あらゆる人工核酸を複製可能な合成大腸菌の創製を目指す。