LRRK2が関わるストレス誘導性リソソーム内容物放出機構の解明

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本研究では、パーキンソン病病因遺伝子産物LRRK2のキナーゼ活性に依存するストレス応答性リソソーム分泌のメカニズム解明を目的とする。リソソーム酵素の細胞外放出を検出する実験系として蛍光基質を用いたb-ヘキソサミニダーゼ活性測定系を確立した。この実験系を用いることにより従来用いてきたウエスタンブロットよりも簡便かつ高感度にリソソーム分泌を評価することができた。この実験系を用い、薬理活性が既知の化合物を対象としたスクリーニングを実施した。化合物は東京大学創薬機構に供与されたValidated Compound Libraryを使用した。培養細胞に対してリソソーム指向性薬剤であるクロロキン(CQ)を添加することでリソソームストレスが生じた際の培地中b-ヘキソサミニダーゼ活性を測定し、十分な活性阻害効果を発揮する化合物の同定を試みた。また、化合物が直接酵素活性を阻害する可能性やリソソームpHに与える影響についても検討を行い、最終的に3910化合物から15化合物についてCQ処理にともなうリソソーム分泌の阻害剤として同定した。これらの化合物についてin vitro kinaseアッセイによるLRRK2キナーゼ活性への影響を評価したところ、いずれもキナーゼ活性の抑制効果は認められなかった。また、これまでに明らかにしたLRRK2の活性評価指標であるCQ処理時のLRRK2のリソソーム局在化、リソソーム肥大化、基質Rab10リン酸化について評価を行ったがそれぞれの化合物において異なる挙動を示した。同定した15化合物はいずれも細胞外放出やリソソーム機能への関与が報告されておらず、既知化合物の新たな薬理作用を見出した可能性がある。また、LRRK2の既知薬理機構への関与も報告されていないため、これらの化合物による放出阻害機構の解明がLRRK2によって制御される新規リソソーム分泌経路の同定につながると考えられる。