Generation and application of hPSC-derived bone organoids based on the human skeletal development

ヒト多能性幹細胞を骨格の起源細胞の一つである沿軸中胚葉（椎板細胞）へ分化させたのちに免疫不全マウス腎皮膜下へ移植することでヒト細胞によって構成される骨組織を作出し、シングルセル解析を実施した。シングルセルRNA-seqに加えてATAC-seqも加えた、シングルセルMultiome解析による結果をさらに検証し、ヒトの骨発生における骨格細胞の遺伝子制御ネットワークについて検討した。各細胞種には独自ないしは共通する転写因子群が活性化していることが明らかとなり、細胞の運命決定や分化、機能維持において様々な転写因子が協調して機能していることが示唆された。一方でこの手法の場合、検出できる転写因子の数に限度があったことから、RNA velocity解析と細胞種特異的な発現遺伝子の組み合わせによって全ての転写因子の中から骨芽細胞分化に重要な因子の抽出を試み、神経や悪性腫瘍の領域では機能がよく知られているものの、骨組織における機能が明らかでなかったZEB2を同定した。ZEB2は骨領域において骨芽細胞のマスターレギュレーターであるRUNX2やSP7と共発現し、shRNAを用いたノックダウンをヒト間葉系幹細胞に行うと、骨芽細胞分化に重要な遺伝子群の発現が低下した。加えて、骨芽細胞特異的にZEB2を欠失させるノックアウトマウスを作出したところ、胎児期ないしは新生児期において骨格の低形成が特に頭顔面部（沿軸中胚葉および神経堤由来）において顕著であることが確認された。これらの結果は、ZEB2が骨発生過程において複数の転写因子群を制御する転写制御ネットワークの一端であることを示唆していると考えられた。以上の内容を国際・国内学会で報告するとともに、国際学術誌であるCell Reportsへ投稿・掲載した。

ヒト多能性幹細胞を骨格の起源細胞の一つである沿軸中胚葉（椎板細胞）へ分化させたのちに免疫不全マウス腎皮膜下へ移植することでヒト細胞によって構成される骨組織を作出し、シングルセル解析を実施した。シングルセルRNA-seqに加えてATAC-seqも加えた、シングルセルMultiome解析による結果をさらに検証し、ヒトの骨発生における骨格細胞の遺伝子制御ネットワークについて検討した。各細胞種には独自ないしは共通する転写因子群が活性化していることが明らかとなり、細胞の運命決定や分化、機能維持において様々な転写因子が協調して機能していることが示唆された。一方でこの手法の場合、検出できる転写因子の数に限度があったことから、RNA velocity解析と細胞種特異的な発現遺伝子の組み合わせによって全ての転写因子の中から骨芽細胞分化に重要な因子の抽出を試み、神経や悪性腫瘍の領域では機能がよく知られているものの、骨組織における機能が明らかでなかったZEB2を同定した。ZEB2は骨領域において骨芽細胞のマスターレギュレーターであるRUNX2やSP7と共発現し、shRNAを用いたノックダウンをヒト間葉系幹細胞に行うと、骨芽細胞分化に重要な遺伝子群の発現が低下した。加えて、骨芽細胞特異的にZEB2を欠失させるノックアウトマウスを作出したところ、胎児期ないしは新生児期において骨格の低形成が特に頭顔面部（沿軸中胚葉および神経堤由来）において顕著であることが確認された。これらの結果は、ZEB2が骨発生過程において複数の転写因子群を制御する転写制御ネットワークの一端であることを示唆していると考えられた。以上の内容を国際・国内学会で報告するとともに、国際学術誌であるCell Reportsへ投稿・掲載した。