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新規ゲノム編集タンパク質Cas12aによるB型肝炎ウイルス排除に関する検討

新型基因组编辑蛋白Cas12a消除乙型肝炎病毒的研究

基本信息

批准号：
21J13970
负责人：
塚本智仁
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J13970/
关键词：
ゲノム編集 CRISPR Cas12a 感染防御 B型肝炎ウイルス HBV アデノウイルスベクター遺伝子治療

项目摘要

CRISPR-Cas9は、ウイルスゲノムを切断することで感染を抑制可能であることから、感染症に対する新たな治療法として注目されている。B型肝炎ウイルス（HBV）によって発症するB型肝炎は、既存の薬剤でHBVゲノムを完全に排除することは極めて困難であることから、ゲノム編集によるウイルス療法の治療標的とされる。これまで、Cas9によるHBVゲノムの完全排除を目指した検討が行われてきたが、未だHBVの十分な排除には至っておらず、HBVを完全に排除可能な優れたゲノム編集ツールの開発が期待される。Cas9とは異なるゲノム編集タンパク質であるCas12aは、Cas9と同様の特異的な二本鎖DNA切断活性に加えて、塩基配列非特異的な一本鎖DNA切断活性を有する。他方でHBV粒子内のゲノムは、不完全環状二本鎖DNAであり、一本鎖DNA領域を有している。したがって、Cas12aはHBVゲノムの二本鎖DNA領域を切断すると同時に、一本鎖DNA領域を切断することにより、Cas9と比較して効率良くHBVゲノムを排除できる可能性を秘めている。そこで本研究では、HBV感染モデルにおいて、Cas12aがHBVゲノムを効率的に排除可能か検討することとした。初年度の検討で、Cas12aの核局在性を高めることにより、Cas12aのゲノム編集効率は著しく向上した。本年度は、通常の二本鎖DNA切断活性によるHBVの感染抑制効果に関する検討に着手した。まずHBV感染モデル動物への適用を見据え、HBVに対するガイドRNAおよびCas12a搭載アデノウイルスベクターの作製を行った。今後は作製したCas12a搭載アデノウイルスベクターを用い、培養細胞においてCas12aがCas9よりも強力にHBV感染を抑制可能か検討する予定である。

CRISPR-Cas9 has the potential to suppress infections by cutting off essential functions, and new treatments for infectious diseases are attracting attention. Hepatitis B virus (HBV) is a disease that can be completely eliminated from existing hepatitis B virus. It is extremely difficult to compile HBV therapy. The complete exclusion of HBV from Cas9 indicates that the development of HBV is expected to be completed without the full exclusion of HBV. Cas9 and Cas12 have the same specific DNA cleavage activity as Cas9 and the same nonspecific DNA cleavage activity as Cas9. In other words, HBV particles contain incomplete circular double-locked DNA and single-locked DNA. Cas 12a has a high probability of HBV infection in both DNA regions, and Cas9 has a high probability of HBV infection in both DNA regions. In this study, HBV infection was detected and Cas 12a was used to exclude possible HBV infection. In the first year of the review, Cas 12a's audit performance was high, and Cas 12a's compilation efficiency was high. This year, we have begun to investigate the effects of HBV infection inhibition on DNA cleavage activity in general. The application of HBV infection in animals is reported, and the operation of HBV infection in animals is carried out. In the future, Cas12a will be used for cell culture, and Cas12a will be used for strong inhibition of HBV infection.