翻訳過程におけるtRNAの使用頻度による遺伝子発現制御機構の解明

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翻訳過程において、tRNAの量や種類の違いが翻訳速度を制御する一因であることが明らかになっている。本研究では、細胞内の翻訳伸長中に用いられたtRNAの使用頻度を調べ、その比率が遺伝子発現制御に及ぼしている影響を解明することを目標としている。本年度において、tRNAの使用頻度算出に必要なtRNAのシーケンシングに向けた条件検討を行った。まず、tRNA使用頻度を実際に算出する際に行うtRNA の次世代シーケンサーによる解析に向けて、逆転写反応、PCR等の一連の実験条件を検討し、cDNAライブラリー作製のための最適化を行った。また、tRNA使用頻度算出の定量解析のための「物差し」として用いるため、単離精製した各種tRNAの等量混合物の次世代シーケンシング解析を行い、tRNA配列に依存した実験過程におけるバイアスを明らかにすることができた。加えて、tRNA使用頻度算出に実際に用いるサンプルの調製方法の検討を行った。大腸菌の細胞からリボソーム内のtRNA を抽出し、その定量的な解析を行う過程において、解析対象であるペプチジルtRNAのほかにデアシルtRNAやアミノアシルtRNAが混入することが課題となっていた。これらのtRNAを排除する方法として、銅触媒を用いたアミノアシルtRNA 選択的な脱アシル処理および過ヨウ素酸によるtRNA 3’末端のシスジオールの酸化処理の反応条件を決定し、ペプチジルtRNAのみを選択的にcDNA化して、次世代シーケンシングによるtRNA配列解析を行った。現在詳細な解析を行っており、tRNAのコドンごとの使用頻度を明らかにする予定である。