ヒトiPS細胞の革新的な非凍結密閉系保存技術の開発

开发人类iPS细胞创新非冷冻密闭储存技术

• 批准号: 21K04786
• 负责人: 大貫 喜嗣
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: University of Yamanashi
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K04786/
• 关键词: ヒトiPS細胞; 非凍結保管

本研究では、コンタミネーションのリスクを回避したまま、凍結および解凍作業を必要としない革新的密閉系非凍結保管方法の開発を目指す。本年度は、本非凍結保存法であるポリオレフィン製プレートシールによる密閉低温保存法（POF非凍結保管法）において、ヒトiPS細胞の生存率を向上させる因子の探索を行った。培養したヒトiPS細胞（201B7）を、POF製プレートシールで密閉し、3から12日間、4℃にての非凍結保存したヒトiPS細胞を37℃に復温し、再培養した。復温後の生存率および復温後の生存率を評価した。低温保存時に使用した培地は0.04%（大気）および1-10％二酸化炭素分圧条件下で平衡したものを使用した。その結果、POF非凍結保管法を実施したヒトiPS細胞は、10%二酸化炭素分圧によって平衡化した培地（pH7.38）を使用することによって60%以上の生存率を示した。これは、通常使用されている5%二酸化炭素分圧条件下で平衡した培地（pH 7.5）を使用した場合の生存率である30％を大幅に上回るものであった。また、二酸化炭素分圧依存的に生存率が向上した。さらに、OCT3/4レポーター遺伝子導入株である201B7-OCT3/4-GFP株を用いて非凍結保管を実施した。低温保管後の201B7-OCT3/4-GFP株をフローサイトメトリーによって解析したところ、低温保管が未分化性に及ぼす影響はなかった。一方、POF非凍結保管法において、ヒトiPS細胞の生存率を向上させる化合物の探索を行った。その結果、レチノイン酸、カプリン酸、N-Acetyl-L-cysteine、を使用したところ細胞の生存性が向上した。このため、POF非凍結保管法に適した化合物が存在する可能性が明らかとなった。

This study aims to develop an innovative non-freezing storage method for closed systems, which is necessary to avoid freezing, thawing and freezing of storage equipment. This year, we explored the factors that influence the survival rate of iPS cells by the non-freezing preservation method (POF). iPS cells (201B7) were cultured and maintained in a POF atmosphere for 12 days at 4℃ and then re-incubated at 37℃. The survival rate after rewarming was evaluated. When stored at low temperature, it is used under the condition of 0.04%(high temperature) and 1-10% diacid carbon pressure. The results showed that the survival rate of iPS cells was above 60% when the POF non-freezing storage method was applied, and the equilibrium temperature of 10% carbon dioxide was maintained at pH 7.38. However, when used in balanced cultivation (pH 7.5) under the usual pressure of 5% diacidified carbon dioxide, the survival rate has increased significantly to 30%. The survival rate of carbon dioxide is higher than that of carbon dioxide. OCT3/4-GFP introduced strain 201B7-OCT3/4-GFP was stored in the middle of the day without freezing. 201B7-OCT3/4-GFP strain after low temperature storage The survival rate of iPS cells was improved by the method of one-side and POF non-freezing preservation. The results showed that the viability of the cells increased with the use of N-Acetyl-L-Cysteine, N-Acetyl-L-Cytidine, and N-Acetyl-L-Cytidine. The possibility of the existence of the compound in the unfrozen storage method of POF is obvious.

项目成果

保存培地のpH がヒトiPS 細胞の新規非凍結保存安定性に及ぼす影響

储存介质 pH 值对人 iPS 细胞新型非低温储存稳定性的影响

• 发表时间: 2022
• 作者: 佐藤 佑菜;徐 卓然;大貫 喜嗣;田中 佑治;黒澤 尋
• 通讯作者: 黒澤 尋