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培養温度制御に基づく真核細胞への遺伝子導入の効率化

基于培养温度控制提高基因转移至真核细胞的效率

基本信息

批准号：
21K04789
负责人：
勝田知尚
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では，研究代表者らが緑藻の培養で見出した，培養温度を適切な範囲で周期的に変化させると培養液中の細胞間で細胞周期が同調するという知見に基づき，真核細胞の細胞周期を同調させて核膜の消失から再構成される間にあわせて外来遺伝子を導入することにより，その核内移行，ならびに核 DNA との接触を促進させて，遺伝子導入の効率化を図ることを目的としている．令和 4 年度は，昨年度から引き続き，子宮頸がんやインフルエンザ，さらに新型コロナウイルス感染症のワクチン生産に用いられている昆虫細胞に注目し，組換えタンパク質の高発現を期待できるとされる Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 (High Five) 細胞を対象として実験を行った．培養温度をプログラム制御したインキュベーター内で連続的にモニタリングされた細胞密度の増加とともに，培養中に経時的に収穫したサンプルのフローサイトメーター分析による細胞内の核酸含有量の変化から，細胞周期の同調の観察を行った．はじめに，細胞周期阻害剤の添加により，細胞周期の進行を所定の期で停止させたときの細胞内核酸含有量の経時的変化を調べた．G2/M 期で停止させる阻害剤では細胞内核酸含有量のピークに無添加条件からの変位は生じなかったが，G1/S 期で停止させる 2'-デオキシ-5-フルオロウリジン (FdUrd) では無添加条件のピークよりも低含有量側にピークが変位することを見出した．つぎに，培養温度を最適温度の 27℃ より低下させたときの細胞内核酸含有量の経時的変化を調べた．その結果，培養温度 17℃ では，FdUrd と同様に，無添加条件のピークよりも低含有量側へのピーク変位が見られた．以上のことから，High Five 細胞では多くの細胞が G2 期にあり，またそれが長時間維持されることが示唆された．

In this study, the representative of the study showed that the culture of green algae was conducted at the appropriate temperature, the cell cycle was changed, the cell cycle was synchronized between cells in the culture medium, the cell cycle of eukaryotes was synchronized, the nuclear membrane was disappeared, the recombination was introduced, the nuclear migration was promoted, and the nuclear DNA contact was promoted. The purpose of the introduction of the gene is to improve the quality of the gene. In the fourth year of the year, the number of insect cells used in the production of new types of cervical infections was increased, and the high level of expression of Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 (High Five) cells was expected to be replaced. Culture temperature is controlled by the increase of cell density, and the change of nucleic acid content in cells during culture is controlled by the increase of cell density. The cell cycle progression is regulated by the addition of cell cycle inhibitors at a given time point, the cessation of cell cycle inhibitors at a given time point, and the change in intracellular nucleic acid content at a given time point. The G2/M phase is regulated by the addition of cell cycle inhibitors at a given time point. G1/S period stops at 2'--5-(FdUrd) In addition, the optimal culture temperature is 27℃, and the intracellular nucleic acid content is adjusted. As a result, the culture temperature is 17℃, FdUrd is the same, no addition condition and low content side is the same. High Five cells are in G2 phase and maintain for a long time.