培養温度制御に基づく真核細胞への遺伝子導入の効率化

本研究では，研究代表者らが緑藻の培養で見出した，培養温度を適切な範囲で周期的に変化させると培養液中の細胞間で細胞周期が同調するという知見に基づき，真核細胞の細胞周期を同調させて核膜の消失から再構成される間にあわせて外来遺伝子を導入することにより，その核内移行，ならびに核 DNA との接触を促進させて，遺伝子導入の効率化を図ることを目的としている．令和 4 年度は，昨年度から引き続き，子宮頸がんやインフルエンザ，さらに新型コロナウイルス感染症のワクチン生産に用いられている昆虫細胞に注目し，組換えタンパク質の高発現を期待できるとされる Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 (High Five) 細胞を対象として実験を行った．培養温度をプログラム制御したインキュベーター内で連続的にモニタリングされた細胞密度の増加とともに，培養中に経時的に収穫したサンプルのフローサイトメーター分析による細胞内の核酸含有量の変化から，細胞周期の同調の観察を行った．はじめに，細胞周期阻害剤の添加により，細胞周期の進行を所定の期で停止させたときの細胞内核酸含有量の経時的変化を調べた．G2/M 期で停止させる阻害剤では細胞内核酸含有量のピークに無添加条件からの変位は生じなかったが，G1/S 期で停止させる 2'-デオキシ-5-フルオロウリジン (FdUrd) では無添加条件のピークよりも低含有量側にピークが変位することを見出した．つぎに，培養温度を最適温度の 27℃ より低下させたときの細胞内核酸含有量の経時的変化を調べた．その結果，培養温度 17℃ では，FdUrd と同様に，無添加条件のピークよりも低含有量側へのピーク変位が見られた．以上のことから，High Five 細胞では多くの細胞が G2 期にあり，またそれが長時間維持されることが示唆された．

本研究では，研究代表者らが緑藻の培養で見出した，培養温度を適切な範囲で周期的に変化させると培養液中の細胞間で細胞周期が同調するという知見に基づき，真核細胞の細胞周期を同調させて核膜の消失から再構成される間にあわせて外来遺伝子を導入することにより，その核内移行，ならびに核 DNA との接触を促進させて，遺伝子導入の効率化を図ることを目的としている．令和 4 年度は，昨年度から引き続き，子宮頸がんやインフルエンザ，さらに新型コロナウイルス感染症のワクチン生産に用いられている昆虫細胞に注目し，組換えタンパク質の高発現を期待できるとされる Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 (High Five) 細胞を対象として実験を行った．培養温度をプログラム制御したインキュベーター内で連続的にモニタリングされた細胞密度の増加とともに，培養中に経時的に収穫したサンプルのフローサイトメーター分析による細胞内の核酸含有量の変化から，細胞周期の同調の観察を行った．はじめに，細胞周期阻害剤の添加により，細胞周期の進行を所定の期で停止させたときの細胞内核酸含有量の経時的変化を調べた．G2/M 期で停止させる阻害剤では細胞内核酸含有量のピークに無添加条件からの変位は生じなかったが，G1/S 期で停止させる 2'-デオキシ-5-フルオロウリジン (FdUrd) では無添加条件のピークよりも低含有量側にピークが変位することを見出した．つぎに，培養温度を最適温度の 27℃ より低下させたときの細胞内核酸含有量の経時的変化を調べた．その結果，培養温度 17℃ では，FdUrd と同様に，無添加条件のピークよりも低含有量側へのピーク変位が見られた．以上のことから，High Five 細胞では多くの細胞が G2 期にあり，またそれが長時間維持されることが示唆された．