Construction of simple biocatalyst for efficient bioconversion

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2022年度は有用物質変換触媒の構築と反応場の解析を実施した。1. 有用物質変換触媒の構築フェルラ酸を変換するシンプル酵素触媒の構築を行った。これまでに構築したシンプル酵素触媒ではバニリンへの変換は可能であるものの、さらなる収率と収量の向上を目指して、遺伝子発現系の改変を行った。2段階での酵素反応のうち、酵素活性が低い酸化酵素をプロモーター直下に配置した発現プラスミドの導入により、生産性の向上が確認された。また、大腸菌のタンパク質発現系に利用されるT7発現システムを構築すべく、T7 RNAポリメラーゼとT7プロモーターを酵素発現プラスミドに導入した。想定された配列の挿入は確認されたものの、酵素の顕著な発現は認められなかった。T7 RNAポリメラーゼの転写活性が確認されなかったことから本系が機能していないことが示され、今後、その他の発現系の導入を含めて発現系の改良を行う。2. 反応場の解析酵素変換の場となる細胞外への酵素漏出について、熱処理による影響を解析した。緑色蛍光タンパク質 (GFP)と融合させて発現させたサイズの異なる複数の酵素タンパク質について、熱処理した細胞懸濁液を遠心分離で上清と細胞画分に分け、GFP蛍光測定により局在を調べた。その結果、サイズの小さなGFPのみでは上清にその大部分が確認されたことから細胞外に漏出したことが示されたが、酵素と融合したものでは細胞外への漏出は低下した。また、本触媒の宿主は海洋性微生物を用いていることから海水での培養を行ったところ、熱処理後の細胞外漏出が低下した。今後、要因となる成分の解析を進め、酵素触媒の培養・反応条件の検討を進める。