細胞表層を反応場としたタンパク質間相互作用解析系の構築

本研究では、培養細胞の表層を反応場として利用したタンパク質間相互作用解析系を構築することを目的としている。具体的にはターゲットとなる標的タンパク質を、膜タンパク質を介して培養細胞の表層に発現させ、そこに蛍光ラベル化したもう一方のタンパク質を添加して、両者の相互作用を蛍光イメージングにより解析する系の構築を目指している。今年度は、タンパク質間相互作用のモデル系として、Rapamycin（抗生物質）によって結合が促進されることがよく知られている、FKBP12とFRB間の相互作用を利用して解析系の構築を行った。ここでは FKBP12 を細胞表層に提示し、GFPでラベル化したFRB（GFP-FRB）を添加して評価を行った。その結果、膜タンパク質とFKBP12の融合タンパク質を発現させた細胞に、Rapamycinと共にGFP-FRBを添加したところ、細胞表層からGFPに由来する蛍光を顕著に観察することができた。一方でRapamycin非共存下では細胞表層からの顕著な結合は観察できなかったため、本系を利用してFKBP12とFRB間の特異的な結合をモニターできることがわかった。しかしながら、細胞が存在しない培養ディッシュ表面へのGFP-FRBの非特異的な結合が予想以上に起こることがわかったため、ディッシュ表面のコーティング方法を検討した。その結果、コラーゲンコーティングを行うことにより、ある程度GFP-FRBの非特異的な結合を抑えることができることがわかった。また今年度は上記の検討と共に、細胞表層に提示させる標的タンパク質のN末端にタグを連結して、そのタグを利用してN末端部位が細胞表層に提示されていることを確認できる系の構築を行った。具体的には、FKBP12と膜タンパク質の融合タンパク質のN末端にタグとしてBCCPを連結させた発現系を構築した。

本研究では、培養細胞の表層を反応場として利用したタンパク質間相互作用解析系を構築することを目的としている。具体的にはターゲットとなる標的タンパク質を、膜タンパク質を介して培養細胞の表層に発現させ、そこに蛍光ラベル化したもう一方のタンパク質を添加して、両者の相互作用を蛍光イメージングにより解析する系の構築を目指している。今年度は、タンパク質間相互作用のモデル系として、Rapamycin（抗生物質）によって結合が促進されることがよく知られている、FKBP12とFRB間の相互作用を利用して解析系の構築を行った。ここでは FKBP12 を細胞表層に提示し、GFPでラベル化したFRB（GFP-FRB）を添加して評価を行った。その結果、膜タンパク質とFKBP12の融合タンパク質を発現させた細胞に、Rapamycinと共にGFP-FRBを添加したところ、細胞表層からGFPに由来する蛍光を顕著に観察することができた。一方でRapamycin非共存下では細胞表層からの顕著な結合は観察できなかったため、本系を利用してFKBP12とFRB間の特異的な結合をモニターできることがわかった。しかしながら、細胞が存在しない培養ディッシュ表面へのGFP-FRBの非特異的な結合が予想以上に起こることがわかったため、ディッシュ表面のコーティング方法を検討した。その結果、コラーゲンコーティングを行うことにより、ある程度GFP-FRBの非特異的な結合を抑えることができることがわかった。また今年度は上記の検討と共に、細胞表層に提示させる標的タンパク質のN末端にタグを連結して、そのタグを利用してN末端部位が細胞表層に提示されていることを確認できる系の構築を行った。具体的には、FKBP12と膜タンパク質の融合タンパク質のN末端にタグとしてBCCPを連結させた発現系を構築した。