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細胞表層を反応場としたタンパク質間相互作用解析系の構築

以细胞表面为反应场的蛋白质-蛋白质相互作用分析系统的构建

基本信息

批准号：
21K05130
负责人：
末田慎二
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyushu Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、培養細胞の表層を反応場として利用したタンパク質間相互作用解析系を構築することを目的としている。具体的にはターゲットとなる標的タンパク質を、膜タンパク質を介して培養細胞の表層に発現させ、そこに蛍光ラベル化したもう一方のタンパク質を添加して、両者の相互作用を蛍光イメージングにより解析する系の構築を目指している。今年度は、タンパク質間相互作用のモデル系として、Rapamycin（抗生物質）によって結合が促進されることがよく知られている、FKBP12とFRB間の相互作用を利用して解析系の構築を行った。ここでは FKBP12 を細胞表層に提示し、GFPでラベル化したFRB（GFP-FRB）を添加して評価を行った。その結果、膜タンパク質とFKBP12の融合タンパク質を発現させた細胞に、Rapamycinと共にGFP-FRBを添加したところ、細胞表層からGFPに由来する蛍光を顕著に観察することができた。一方でRapamycin非共存下では細胞表層からの顕著な結合は観察できなかったため、本系を利用してFKBP12とFRB間の特異的な結合をモニターできることがわかった。しかしながら、細胞が存在しない培養ディッシュ表面へのGFP-FRBの非特異的な結合が予想以上に起こることがわかったため、ディッシュ表面のコーティング方法を検討した。その結果、コラーゲンコーティングを行うことにより、ある程度GFP-FRBの非特異的な結合を抑えることができることがわかった。また今年度は上記の検討と共に、細胞表層に提示させる標的タンパク質のN末端にタグを連結して、そのタグを利用してN末端部位が細胞表層に提示されていることを確認できる系の構築を行った。具体的には、FKBP12と膜タンパク質の融合タンパク質のN末端にタグとしてBCCPを連結させた発現系を構築した。

In this study, the surface reaction field of cultured cells was used to construct an analytical system for mass-to-mass interaction. The specific objective is to construct a system for the development of surface layers of cultured cells, for the addition of light and for the analysis of light and for the interaction between light and membrane. This year, the interaction between FKBP12 and FRB was used to construct the analytical system. FKBP12 cell surface layer prompt, GFP, FRB (GFP-FRB), add and comment As a result, the fusion protein of FKBP12 was detected in the cell surface, Rapamycin and GFP-FRB were added, and GFP was detected in the cell surface. Rapamycin non-blue shift under the cell surface layer The non-specific binding of GFP-FRB in culture and cell culture was discussed. As a result, This year, we will record the information on the cell surface, and confirm the construction of the cell surface. Specifically, FKBP12 is a membrane fusion protein that is linked to the N-terminal region of the membrane.