転写・内在tRNAハイブリッド無細胞翻訳系を用いたアミノ酸入れ替え遺伝暗号の構築

使用转录/内源tRNA杂合无细胞翻译系统构建氨基酸置换遗传密码

• 批准号: 21K05270
• 负责人: 藤野 公茂
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05270/
• 关键词: 無細胞翻訳系; キメラtRNA; 改変遺伝暗号; tRNA; 遺伝暗号

申請者が先行研究で提案したアミノ酸入れ替え(AS)遺伝暗号は、Ser, Leuコドンの交換により、普遍遺伝暗号との直交性を確立している。この系は、試験管内翻訳系により、危険な遺伝子を用いず研究対象のタンパク質のみを得る手段として有用である。しかし、AS遺伝暗号を持つ翻訳系は、タンパク質合成量が、通常の系の10分の1程度と低いという問題があった。これは、用いたtRNAが転写後修飾を持たず、必要最小限の21種類しか用意していないことが原因であると考えられる。そこで、本研究では、『大腸菌抽出の内在tRNAと、試験管内転写tRNAを組み合わせることにより、翻訳合成活性の高いアミノ酸入れ替え遺伝暗号を構築すること』を目指した。初年度である2021年には、変性PAGEを用いることで、内在tRNAからSer, LeuのtRNAのみを選択的に除去する方法を考案した。ここに、試験管内転写により合成した2種類のキメラtRNAを添加することで、内在・転写ハイブリッドtRNAを構築することに成功した。このハイブリッドtRNAを用いることで、ペプチドとタンパク質のアミノ酸入れ替え翻訳合成が可能であることも示した。2022年度の取り組みでは、アミノ酸入れ替え翻訳系で利用可能なコドンの拡大を目指して研究を進めた。前年度の段階で構築した翻訳系は、Ser, Leuに対応するtRNAが各1種類であるため、利用可能なコドンの数が、理論上の最大で64個中54個であった。そこで、Ser, Leuに対応するキメラtRNAをさらに追加し、利用可能なコドンを61個まで拡張することを目指した。利用可能なコドンが増えることで、遺伝子の設計時におけるコドン選択の自由度が上がり、遺伝子から翻訳合成によって得られる研究対象となるタンパク質収量の増加が期待される。

Applicants が で leading research proposal し た ア ミ ノ acid into れ for え (AS) heritage 伝 cipher は, Ser, Leu コ ド ン の exchange に よ り, universal heritage 伝 cipher と の rectangular を established し て い る. こ の は, test tube turn 訳 に よ り, dangerous 険 な posthumous son 伝 を with い ず research like の seaborne タ ン パ ク qualitative の み を means to る と し て useful で あ る. し か し, AS legacy code 伝 を hold つ turn 訳 は, タ ン パ ク quality synthetic quantity が, 1 degree usually の is の 10 の と low い と い う problem が あ っ た. こ れ は, use い た tRNA が planning modification after writing を hold た ず, necessary minimum limit の 21 kinds し か intention し て い な い こ と が reason で あ る と exam え ら れ る. そ こ で, this study で は, "coliform drew の inner tRNA と, planning to write test tube tRNA を group み close わ せ る こ と に よ り, turn 訳 synthesis high active の い ア ミ ノ acid into れ for え legacy code 伝 を build す る こ と" を refers し た. Early annual で あ る 2021 に は, - PAGE を with い る こ と で, inner tRNA か ら Ser, Leu の tRNA の み を sentaku に remove す る method し を test case た. こ こ に, planning to write test tube に よ り synthetic し た 2 kinds の キ メ ラ tRNA を add す る こ と で, internal planning write ハ イ ブ リ ッ ド tRNA を build す る こ と に successful し た. こ の ハ イ ブ リ ッ ド tRNA を with い る こ と で, ペ プ チ ド と タ ン パ ク qualitative の ア ミ ノ acid into れ for え turn 訳 synthetic が may で あ る こ と も shown し た. Group 2022 annual の り み で は, ア ミ ノ acid into れ え turn 訳 tie で may use な コ ド ン の company, big を refers し を て research into め た. Before the annual の Duan Jie で build し た turn 訳 は, Ser, Leu に 応 seaborne す る tRNA が types 1 で あ る た め, may use な コ ド ン の が, theoretically の で biggest 64 54 で あ っ た. そ こ で, Ser, Leu に 応 seaborne す る キ メ ラ tRNA を さ ら に additional し, may use な コ ド ン を 61 ま で company, zhang す る こ と を refers し た. May use な コ ド ン が raised え る こ と で, but 伝 の design に お け る コ ド ン sentaku の freedom on が が り, but 伝 か ら turn 訳 synthetic に よ っ て have ら れ る research like と seaborne な る タ ン パ ク quality 収 quantity の raised が expecting さ れ る.

项目成果

転写・抽出tRNAを用いた高効率Ser/Leu交換翻訳系の開発

使用转录/提取的 tRNA 开发高效 Ser/Leu 交换翻译系统

• 发表时间: 2022
• 作者: Kubo Anna;Tanei Tomonori;Pradipta Ambara R;Morimoto Koji;Fujii Motoko;Sota Yoshiaki;Miyake Tomohiro;Kagara Naofumi;Shimoda Masafumi;Naoi Yasuto;Motoyama Yuichi;Morii Eiichi;Tanaka Katsunori;Shimazu Kenzo;園田 凌吾,藤野 公茂,村上 裕
• 通讯作者: 園田 凌吾,藤野 公茂,村上 裕

Construction of a Highly Diverse mRNA Library for in vitro Selection of Monobodies

• DOI: 10.21769/bioprotoc.4125
• 发表时间: 2021-08-20
• 期刊: BIO-PROTOCOL
• 影响因子: 0.8
• 作者: Kondo, Taishi;Eguchi, Minori;Murakami, Hiroshi
• 通讯作者: Murakami, Hiroshi

創薬研究者がこれだけは知っておきたい最新のウイルス学

药物发现研究人员需要了解的最新病毒学知识

• 发表时间: 2021
• 作者: 執筆者:101名;技術情報協会
• 通讯作者: 技術情報協会

アミノ酸交換遺伝暗号の構築

氨基酸交换遗传密码的构建

• 发表时间: 2021
• 作者: 有安 真也;児玉 侑朔;愛場 雄一郎;荘司 長三;Yuya Komatsu; Jun Sugiyama; Ryota Shimizu; Kazunori Nishio; Masahiro Miyauchi; Markus Wilde; Katsuyuki Fukutani; Ryan McFadden; Martin Dehn; Victoria Karner; Derek Fujimoto; John Ticknor; Aris Chatzichristos; Monika Stachura; David Cortie; Gerald Morris; ;藤野公茂,戸崎将弘,村上裕
• 通讯作者: 藤野公茂,戸崎将弘,村上裕

WYP-rich大環状ペプチドライブラリの構築

富含WYP的大环肽库的构建

• 发表时间: 2022
• 作者: Kondo Taishi;Eguchi Minori;Tsuzuki Nariaki;Murata Naoya;Fujino Tomoshige;Hayashi Gosuke;Murakami Hiroshi;藤野公茂,鷲見大河,村上 裕
• 通讯作者: 藤野公茂,鷲見大河,村上 裕