転写・内在tRNAハイブリッド無細胞翻訳系を用いたアミノ酸入れ替え遺伝暗号の構築

点击翻译按钮获取中文摘要

申請者が先行研究で提案したアミノ酸入れ替え(AS)遺伝暗号は、Ser, Leuコドンの交換により、普遍遺伝暗号との直交性を確立している。この系は、試験管内翻訳系により、危険な遺伝子を用いず研究対象のタンパク質のみを得る手段として有用である。しかし、AS遺伝暗号を持つ翻訳系は、タンパク質合成量が、通常の系の10分の1程度と低いという問題があった。これは、用いたtRNAが転写後修飾を持たず、必要最小限の21種類しか用意していないことが原因であると考えられる。そこで、本研究では、『大腸菌抽出の内在tRNAと、試験管内転写tRNAを組み合わせることにより、翻訳合成活性の高いアミノ酸入れ替え遺伝暗号を構築すること』を目指した。初年度である2021年には、変性PAGEを用いることで、内在tRNAからSer, LeuのtRNAのみを選択的に除去する方法を考案した。ここに、試験管内転写により合成した2種類のキメラtRNAを添加することで、内在・転写ハイブリッドtRNAを構築することに成功した。このハイブリッドtRNAを用いることで、ペプチドとタンパク質のアミノ酸入れ替え翻訳合成が可能であることも示した。2022年度の取り組みでは、アミノ酸入れ替え翻訳系で利用可能なコドンの拡大を目指して研究を進めた。前年度の段階で構築した翻訳系は、Ser, Leuに対応するtRNAが各1種類であるため、利用可能なコドンの数が、理論上の最大で64個中54個であった。そこで、Ser, Leuに対応するキメラtRNAをさらに追加し、利用可能なコドンを61個まで拡張することを目指した。利用可能なコドンが増えることで、遺伝子の設計時におけるコドン選択の自由度が上がり、遺伝子から翻訳合成によって得られる研究対象となるタンパク質収量の増加が期待される。