Terminal hydroxylation by cytochrome P450s induced by dummy substrates

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本計画では、シトクロムP450に擬似基質を添加して、化学的に反応性の低い末端の1級炭素に選択的に水酸基を導入する技術の創製を目指して研究を行っている。昨年度の検討により、これまで擬似基質を用いた反応システムで最も研究が行われてきた巨大菌由来の長鎖脂肪酸水酸化酵素P450BM3や、その類縁酵素（CYP102シリーズ）では、いずれの擬似基質でもプロパン水酸化において、目的とする末端1級炭素の水酸化率は10%以下であったのに対し、自然界で長鎖脂肪酸の末端を水酸化しているCYP153の一種CYP153A33を用いたところ約80%の選択率で末端1級炭素水酸化が可能であることを明らかにした。本成果を受けて、2022年度は、申請計画通り、CYP153A33に適した擬似基質の探索を行った。これまでにP450BM3用に開発した200種類ほどの擬似基質のうち、末端がフッ素分子で修飾されているデコイ分子、約30種類をCYP153A33に添加し、申請者が開発した微小高圧反応装置を用いたプロパン水酸化を検討した。その結果、いずれのデコイ分子においても、目的とした末端1級炭素選択的水酸化能を示し、その比率は擬似基質の構造に関わらず、80%前後であった。このことは、本反応における位置選択性が擬似基質よりもCYP153A33が持つ、細長い基質ポケットの形状に依存していることを示している。また、P450BM3においては、フッ素修飾した擬似基質よりも、修飾がない一般的な炭素-水素結合で構成された擬似基質の方が、その合成の容易さ、市販のビルディングブロックの多様さから、構造最適化が行いやすく、フッ素修飾擬似基質よりも高活性を示していることから、CYP153A33においても、非フッ素修飾擬似基質の適用を試みたが、予期に反して、プロパン等の水酸化活性はほとんど示さないことを明らかにした。