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S-スルフヒドリル化タンパク質の網羅的解析による含硫化合物生合成機構の解明

通过S-巯基化蛋白质的综合分析阐明含硫化合物的生物合成机制

基本信息

批准号：
21K05345
负责人：
加藤伸一郎
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kochi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05345/
关键词：
硫黄代謝トレーサー

项目摘要

大腸菌MC4100株を種々の培地組成にて液体振とう培養し、得られた無細胞抽出液にL-[35Ｓ]システインをトレーサーとして加えた。クロラムフェニコールを添加して翻訳を阻害した条件下で37℃、１時間インキュベートした後に試料をSDS-PAGEにより解析したところ、S-スルフヒドリル化されることにより硫黄の転移反応に関与すると考えられるタンパク質バンドがオートラジオグラフィーにより複数検出された。培養条件によりオートラジオグラフィーの結果が異なることから、これらのS-スルフヒドリル化タンパク質は特異的に発現誘導されるものと考えられた。そのうちの一つである分子質量16kDaのバンドはIscUタンパク質であることが判明したため、当該遺伝子をPCRにより調製し大量発現系を構築している。一方、プロテインシークエンサーを用いたエドマン分解では同定することのできないタンパク質もあった。その原因として、試料タンパク質がいずれも極めて微量であること、また、タンパク質のN末端がアセチル化やホルミル化によって修飾されている可能性も考えられた。この発現系より得られた組換えIscUタンパク質について、L-[35Ｓ]システインと大腸菌システインデスルフラーゼIscSを用いた硫黄転移系を用いてin vitroで硫黄受容能を解析した結果、35Ｓ放射標識量が経時的に増大していることが明らかになった。この結果から、IscUタンパク質は本菌株が生成する含硫化合物の合成初期段階において硫黄を供給する役割を担っていることが示唆された。

Escherichia coli MC4100 strain has been cultured in a liquid vibrator, and a cell-free extract of the Escherichia coli MC4100 has been obtained.クロラムフェニコールをAdd the してturn訳をblocker under the conditions of 37℃, 1 time SDS-PAGE sample analysis, S-スルフヒドリル化されることにより sulfur yellow の転movable reverse 応に关与すると卡えられるタンパク性バンドがオートラジオグラフィーによりplural検出された. Culture Conditions -スルフヒドリル化タンパク性はSpecific に発 appear to induce されるものと卡えられた. Molecular mass 16kDa It is clear that the system has been constructed and the PCR system has been modulated in large quantities. One side, プロテインシークエンサーを Use いたエドマン points The solution is the same as the fixed quality もあった.そのCause として, sample タンパクquality がいずれも extremely めて Trace amount であること, また, タンパクThe quality of the N-terminal がアセチル化やホルミル化によってmodificationされているpossibilityも考えられた. The current system of この発 is now made of られた group replacement えIscU タンパクquality について、L-[35Ｓ]シスcoliform bacteria The results of the analysis of the sulfur acceptability in vitro and the 35S radioactive labeling amount are the results of the analysis.このRESULTSから、IscUタンパク性は This strain produces sulfur-containing compounds. In the early stage of growth, the supply of sulfur and sulfur is the same as the supply of sulfur.