非大腸菌タンパク質生産系を併用したモジュラーポリケチド合成酵素の試験管内再構成

使用非大肠杆菌蛋白质生产系统体外重构模块化聚酮合酶。

• 批准号: 21K05404
• 负责人: 湯澤 賢
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05404/
• 关键词: ポリケチド合成酵素; 生化学; 試験管内再構成; 非大腸菌タンパク質生産系; 巨大酵素

モジュラーポリケチド合成酵素（モジュラーPKS）は多様な薬剤の基本骨格の生合成を担う巨大酵素である。モジュラーPKSの生化学的解析や構造生物学的解析は新規薬剤の創出につながる可能性があるため、過去20年に渡り研究が行われている領域である。モジュラーPKSはその大きさ故、野生型酵素のin vitro解析は容易ではなく、これまで試験管内再構成を達成した例は世界でまだ1例しかなく、至適温度、至適pH、至適イオン強度、kcat、KM等の基本的な情報が一般にどんな分布を示すかは明らかになっていない。本研究では、これまで利用されていない非大腸菌タンパク質生産系も併用し、新たに数種類の野生型モジュラーPKSの試験管内再構成およびそれらの生化学的解析を実施することを目的としている。第一のモジュラーPKSに関しては、非大腸菌タンパク質生産系を併用することで試験管内再構成にすでに成功している。現在は引き続き、至適温度、至適pH、至適イオン強度、kcat、KM等の解析を進めている。本成果は未発表であるが、世界で2例目の野生型酵素の試験管内再構成の成功例になり得る。また国内では初の成果となり得る。第二のモジュラーPKSに関しては、プラスミド構築に苦戦しており、まだタンパク質精製の段階に至っていない。初年度の実施報告で述べた第三の系に関して2年目は精力的に研究を進めた。この第三の系は、モジュラーPKSと非リボソーム型ペプチド合成酵素とのハイブリッドの系である。第三の系では計10種類の酵素が再構成には必要であり、これまで７種類に関しては大腸菌を用いたタンパク質生産系で得ることに成功している。一方で残りの３種類に関しては大腸菌ではごく少量のみ、あるいは全く生産されないケースもあった。現在は我々が保有する非大腸菌タンパク質生産系を活用して、残り数種類の酵素の生産を試みている段階である。

The enzyme PKS is responsible for the synthesis of the basic skeleton of multiple drugs. The biochemical analysis of PKS and the structural biology analysis of PKS have made it possible to create new drugs. The research in the past 20 years has been carried out in various fields. Basic information such as PKS size, wild-type enzyme in vitro analysis, and in vitro reconstitution are easy to achieve, and the optimal temperature, pH, and intensity of PKS, kcat, and KM are generally distributed. In this study, we conducted biochemical analysis of the recombinant plasmid using a non-coliform plasmid production system and several novel wild-type PKS strains. The first is the combination of non-E. coli and non-E. coli production systems. Now the analysis of temperature, pH, intensity, kcat, KM, etc. The results show that 2 successful cases of recombination of wild-type enzyme in vitro have been obtained. The first results of the domestic. The second phase of the PKS is related to the construction of the first phase, the second phase and the third phase of the quality refinement. The first year's implementation report describes the third system related to the second year's research. The third system is called PKS, which is a non-transparent type of enzyme. The third system consists of 10 kinds of enzymes, which are necessary for reconstruction, and 7 kinds of enzymes, which are related to the use of Escherichia coli in quality production. One side of the residue of three species of Escherichia coli is not a small amount of food, not a whole production of food. Now we have to keep the non-coliform enzyme production system in use, and try to produce several kinds of enzymes in the middle stage.