脊髄性筋萎縮症に関わるスプライシング制御因子の協同作用の解明

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申請者は、スプライシング制御因子による生体制御の破綻から生じるスプライシング病について構造生物学的な理解を目的としている。本研究では、脊髄性筋萎縮症の発症ではSF2などの制御因子が関わる運動神経細胞生存遺伝子(Survival motor neuron: SMN)の選択的スプライシングの制御不全が起きている。SF2 RRM1と標的配列を含むRNA断片の複合体を結晶化し、これをＸ線結晶構造解析することで、SF2タンパク質の標的配列認識機構を明らかにすることを目標とした。また、他のスプライシング因子に含まれる同様の機能ドメインについての構造解析を試み、この機能ドメインによるクロストークに関する知見を得ようと考えた。昨年度までSF2 RRM1と標的配列を含むRNA断片との結晶化を行って微結晶が得られたが、再現性がなかった。本年度は、結晶化の再現性をあげるために、(1)SF2についてアミノ酸配列の保存性とRRM1単体の構造から、RNA結合能を保持しつつ、構造的に柔軟な部分を最小限に抑えたコンストラクトを作成し結晶化を試みた。(2)また、RNA分子間で塩基対を形成させて結晶パッキングを促進させる目的で、ターゲットとなるRNA分子についてRNA分子間で塩基対を形成させて結晶パッキングを促進させるよう細工をしたRNA断片2種類を用いて、RRM1との共結晶化の条件を検討した。その結果、2種類のRNA共に1つの条件下から結晶を得た。現在、さらに結晶化の条件の最適化を進めている。また、真核生物でスプライシング反応において働くRNA結合ドメインとしてはRRMドメインのほかにKHドメインがある。RNAの二次構造部分の変化によるRNA認識を考察するため、結合に一本鎖部分だけではなく、二次構造をとる部分も必要とするRbfAのKHドメインについて構造決定を行い、下記にしめすように投稿論文として発表した。