PCRによる1分子DNA検出性能の評価

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一般的に、PCRは、僅か１分子のDNAをも検出可能であると考えられてるが、そのような検証は未だなされていない。本研究では、PCRの標的配列を１個単位で制御可能な標準物質を作製、利用し、DNA1分子に対する検出性能の評価を目的としている。1コピーの検出性能を正確に評価するには、確実に標的配列を１コピー含む標準物質の存在が不可欠である。本研究では、当初、このような標準物質として細胞を用いる手法を検討していたが、標準細胞をインクジェットで分注する技術の利用が困難になってしまったため、別のアプローチを試みることとした。具体的には、高濃度のDNAを限界まで希釈する限界希釈法を利用することにした。手法としては、1コピーの標的配列と、それとは別の確認配列を同じDNA分子内に複数コピー導入し、標準DNAとする。このような標準DNAの溶液を限界まで希釈すると、DNAを含む溶液と含まない溶液に分かれ、DNAを含む溶液には、非常に高い確率で1分子のDNAが含まれるものと予想される。1コピーの標的配列が存在している希釈画分を得るために、各分注溶液について、確認配列を標的にPCRを行い、標準DNAの存在を確認する。これにより、細胞法と同等の検証が可能となる。今年度は、このような標準DNAのコンストラクションを行った。文献より、リアルタイムPCRでは、4コピー程度以上のDNAであれば検出可能である旨の報告があることから、確認配列を8コピー導入した標準DNAを作出した。