細胞核構造によるゲノム安定化と老化抑制の機構解明

通过细胞核结构阐明基因组稳定和衰老抑制机制

• 批准号: 21K05497
• 负责人: 堀籠 智洋
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05497/
• 关键词: リボソームRNA遺伝子; rDNA; 核膜; 老化; 若返り; マイクロ流体チップ

課題1　核膜結合がrDNA安定化および細胞老化抑制に果たす役割の解明：　2022年度には、リボソームRNA遺伝子（rDNA）においてDNA二本鎖切断を誘導した時のコヒージョン形成と核膜の位置関係を、顕微鏡を用いて定量解析した。解析では、rDNA反復配列の1箇所にI-SceI切断部位とtetO配列を導入した株を用い、ガラクトースによりI-SceIエンドヌクレアーゼを発現誘導し、その切断部位をTetI-mRFPにより可視化する株を用いた。通常、DNA複製後のDNA二本鎖切断部位は、コヒージョンにより1つの赤色蛍光輝点として観察されるが、コヒージョンに欠陥がある細胞では2点として観察される。コヒージョンが確立した細胞（輝点１つ）では、コヒージョンが確立していない細胞（輝点2つ）の細胞と比べて切断部位が核膜に近接している傾向があることが分かった。核膜結合によるrDNA安定化の作用点を遺伝学的に同定するため、fob1 nup120二重破壊株を構築した。現在sir2 nup120二重破壊株を作製しており、完成後、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）でrDNAの安定性に関する遺伝学的解析を行う。課題2　老化細胞における核膜でのゲノム安定化についての解析：　野生株の酵母細胞をビオチン標識した後に分裂を繰り返させて細胞を老化させ、ストレプトアビジン磁性ビーズにより老化細胞（平均３～4回出芽）を選別した。若い細胞と老化細胞においてMAT遺伝子座にHOエンドヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断を誘導し、核膜とDNA二本鎖切断部位の位置関係を定量的顕微鏡法により解析した。若い細胞と老化細胞いずれにおいても切断誘導前後にその領域が核膜に移動する現象が観察され、老化細胞であっても損傷DNAの核膜への移動は維持されていることが明らかになった。

挑战1：阐明核膜结合在稳定rDNA中的作用和抑制细胞衰老：在2022年，使用显微镜定量分析了核糖体RNA基因（RDNA）中DNA双链断裂时凝聚力形成与核膜之间的位置关系。在分析中，在RDNA重复序列的一个位置引入了I-SCEI裂解位点和TETO序列的应变，并使用半乳糖诱导I-SCEI核酸内切核酸酶的表达，并使用使用TETI-MRFP的裂解位点可视化。通常，DNA复制后的DNA双链断裂位点被观察为单个红色荧光亮点，但在具有缺陷的细胞中以两个点为单位。发现具有凝聚力的细胞（一个亮点）往往比没有亮点（两个亮点）的细胞更接近核膜。为了从遗传上识别核膜结合的rDNA稳定的作用点，构建了FOB1 NUP120双重干扰菌株。当前，正在制备SIR2 NUP120双重损坏性应变，完成后，使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对rDNA稳定性进行遗传分析。任务2：分析核膜上衰老细胞中基因组稳定：对野生酵母菌细胞进行了生物素标记，然后重复分裂以使细胞衰老，并使用链霉亲蛋白磁珠选择了衰老细胞（平均3-4个芽）。在年轻细胞和衰老细胞的MAT基因座中诱导了HO内切核酸酶的DNA双链断裂，并通过定量显微镜分析了核膜与DNA双链断裂位点之间的位置关系。在年轻细胞和衰老细胞中，观察到该区域在裂解诱导前后迁移到核膜的现象，表明即使在衰老细胞中，也将受损的DNA迁移到核膜上。

项目成果

Analysis of the molecular evolution of histone variant H2A.Z using a linker-mediated complex strategy and yeast genetic complementation

使用连接子介导的复杂策略和酵母遗传互补分析组蛋白变体 H2A.Z 的分子进化

• DOI: 10.1093/bbb/zbab190
• 发表时间: 2021
• 期刊: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
• 作者: Kitagawa Saho;Kusakabe Masayuki;Takahashi Daisuke;Narimiya Takumi;Nakabayashi Yu;Seki Masayuki;Horigome Chihiro;Harata Masahiko
• 通讯作者: Harata Masahiko

DNA二本鎖切断部位の核膜結合がゲノム安定化に果たす役割

DNA 双链断裂的核膜结合在基因组稳定中的作用

• 发表时间: 2022
• 作者: 岡田大和;堀川和希;原田昌彦;堀籠智洋
• 通讯作者: 堀籠智洋

DNA損傷誘導性姉妹染色分体間接着には損傷部位と核膜孔との結合が必要である

DNA 损伤诱导的姐妹染色单体粘附需要受损位点与核孔之间的结合。

• 发表时间: 2021
• 作者: 岡田大和;折原行希;高橋大輔;小西辰紀;尾間由佳子;島田健士;Susan M. Gasser;原田昌彦;堀籠智洋
• 通讯作者: 堀籠智洋

東北大学大学院農学研究科・農学部 分子生物化学分野ウェブサイト

东北大学农学研究科/农学部分子生物化学系网站

老化した出芽酵母におけるDNA二本鎖切断の解析

老化酿酒酵母 DNA 双链断裂分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 堀川和希;原田昌彦;堀籠智洋
• 通讯作者: 堀籠智洋