細胞核構造によるゲノム安定化と老化抑制の機構解明

課題1　核膜結合がrDNA安定化および細胞老化抑制に果たす役割の解明：　2022年度には、リボソームRNA遺伝子（rDNA）においてDNA二本鎖切断を誘導した時のコヒージョン形成と核膜の位置関係を、顕微鏡を用いて定量解析した。解析では、rDNA反復配列の1箇所にI-SceI切断部位とtetO配列を導入した株を用い、ガラクトースによりI-SceIエンドヌクレアーゼを発現誘導し、その切断部位をTetI-mRFPにより可視化する株を用いた。通常、DNA複製後のDNA二本鎖切断部位は、コヒージョンにより1つの赤色蛍光輝点として観察されるが、コヒージョンに欠陥がある細胞では2点として観察される。コヒージョンが確立した細胞（輝点１つ）では、コヒージョンが確立していない細胞（輝点2つ）の細胞と比べて切断部位が核膜に近接している傾向があることが分かった。核膜結合によるrDNA安定化の作用点を遺伝学的に同定するため、fob1 nup120二重破壊株を構築した。現在sir2 nup120二重破壊株を作製しており、完成後、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）でrDNAの安定性に関する遺伝学的解析を行う。課題2　老化細胞における核膜でのゲノム安定化についての解析：　野生株の酵母細胞をビオチン標識した後に分裂を繰り返させて細胞を老化させ、ストレプトアビジン磁性ビーズにより老化細胞（平均３～4回出芽）を選別した。若い細胞と老化細胞においてMAT遺伝子座にHOエンドヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断を誘導し、核膜とDNA二本鎖切断部位の位置関係を定量的顕微鏡法により解析した。若い細胞と老化細胞いずれにおいても切断誘導前後にその領域が核膜に移動する現象が観察され、老化細胞であっても損傷DNAの核膜への移動は維持されていることが明らかになった。

課題1　核膜結合がrDNA安定化および細胞老化抑制に果たす役割の解明：　2022年度には、リボソームRNA遺伝子（rDNA）においてDNA二本鎖切断を誘導した時のコヒージョン形成と核膜の位置関係を、顕微鏡を用いて定量解析した。解析では、rDNA反復配列の1箇所にI-SceI切断部位とtetO配列を導入した株を用い、ガラクトースによりI-SceIエンドヌクレアーゼを発現誘導し、その切断部位をTetI-mRFPにより可視化する株を用いた。通常、DNA複製後のDNA二本鎖切断部位は、コヒージョンにより1つの赤色蛍光輝点として観察されるが、コヒージョンに欠陥がある細胞では2点として観察される。コヒージョンが確立した細胞（輝点１つ）では、コヒージョンが確立していない細胞（輝点2つ）の細胞と比べて切断部位が核膜に近接している傾向があることが分かった。核膜結合によるrDNA安定化の作用点を遺伝学的に同定するため、fob1 nup120二重破壊株を構築した。現在sir2 nup120二重破壊株を作製しており、完成後、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）でrDNAの安定性に関する遺伝学的解析を行う。課題2　老化細胞における核膜でのゲノム安定化についての解析：　野生株の酵母細胞をビオチン標識した後に分裂を繰り返させて細胞を老化させ、ストレプトアビジン磁性ビーズにより老化細胞（平均３～4回出芽）を選別した。若い細胞と老化細胞においてMAT遺伝子座にHOエンドヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断を誘導し、核膜とDNA二本鎖切断部位の位置関係を定量的顕微鏡法により解析した。若い細胞と老化細胞いずれにおいても切断誘導前後にその領域が核膜に移動する現象が観察され、老化細胞であっても損傷DNAの核膜への移動は維持されていることが明らかになった。