植物における精密ゲノム編集技術ジーンターゲッティングの効率化

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ゲノム編集技術の一つであるジーンターゲッティング（GT）は、DNA修復経路の一つである相同組換えを介して標的遺伝子を望み通りに改変できるため、植物の基礎研究や作物育種の加速化に非常に重要な技術である。代表者はこれまで、広範な作物種に適用できる汎用的GT系を確立するためにGT効率の簡便な評価システムを構築し、GT効率を向上させる化合物処理や鋳型配列のデリバリー系の開発を行ってきた。その中で、Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 阻害剤処理や分割型Transferred DNA (T-DNA) でGTの鋳型配列をデリバリーすることによってGT効率を向上できることを明らかにしてきた。そこで本課題では、これら2つのアプローチによりGT効率が向上する現象のメカニズムを解明し、その知見からGT実験系のファインチューニングを行い、更なる高効率化とより実効性のある実験系の確立を目指す。令和4年度は、PARP阻害剤処理によるGT効率向上の機構を明らかにすることを目的として、昨年度CRISPR/Cas9システムにより作製したOsPARP1およびOsPARP2Aノックアウトイネを用いて、T-DNA挿入頻度の解析を行うとともに、野生型イネカルスのPARP阻害剤処理がT-DNA挿入頻度に及ぼす影響も解析した。また、PARPの阻害により相同組換え効率が向上するかどうかを評価するため、レポーターの発現により相同組換え効率を簡便に評価できるレポーター系を導入したイネ系統を確立した。分割型T-DNAによる鋳型デリバリーがGT効率を向上させる機構を明らかにするため、分離型および一体型GTベクターを用いて昨年度に作出したGT個体を用いてDroplet Digital PCR（ddPCR）により鋳型コピー数の解析を行った。